環境中には窒素ガスを大気に放出する多くの未知なる微生物が存在していた

窒素は生物を構成する主要な元素であり、植物の成長にとって必須である一方で、窒素の過剰な蓄積は例えば河川の富栄養化を引き起こします。脱窒（だっちつ、注１）は、自然生態系や農耕地からの窒素の損失や排水処理系からの窒素除去をもたらす反応であり、多くの微生物によって担われています（図１）。そのため脱窒微生物の分布や生理・生態は農業や産業の分野においても多くの注目を集めています。しかし、近年のゲノム解析（注２）などの結果から、脱窒に必須な遺伝子である亜硝酸還元酵素遺伝子（注３）のうち、これまで解析対象とされてきたのは全体のごく一部であることが明らかになりつつあります。このことは多くの脱窒微生物が解析対象にされていなかったことを意味します。
　今回、東京大学大学院農学生命科学研究科の磯部一夫助教と妹尾啓史教授らのグループは、既に明らかになっている遺伝子の塩基配列情報を収集・利用して、亜硝酸還元酵素遺伝子を広く検出するための方法を開発しました（図２）。続いて本手法を用いて畑土壌、水田土壌、森林土壌、湖堆積物に含まれる亜硝酸還元酵素遺伝子を解析した結果、すべての環境においてこれまで検出されてきたより多様かつ2-6倍もの豊富な亜硝酸還元酵素遺伝子（脱窒微生物）が存在していることを明らかにしました（図２、３）。また、農耕地土壌から分離した多数の脱窒微生物の生理試験と遺伝子解析の結果と併せて、今回新たに検出した亜硝酸還元酵素遺伝子を有する微生物の多くは、農耕地土壌において強力な温室効果ガスである一酸化二窒素（以下、N₂O；注４）を活発に生成している可能性が高いことを示しました。
　今後、環境中でのN₂Oの生成や脱窒のより精確な推定が可能になることが期待されます。

図１　畑地土壌における脱窒の模式図
脱窒とは硝酸イオン（NO_3–）や亜硝酸イオン（NO_2–）がガス態の窒素化合物（NO、N₂O、N₂）に還元される微生物反応である。本研究においてはNO_2–をNOに還元する酵素をコードする亜硝酸還元酵素遺伝子を解析対象とした。点線矢印は微生物反応を示す。（拡大画像↗）

図２　本研究の手法により新たに検出された亜硝酸還元酵素遺伝子（NirK遺伝子（左）とNirS遺伝子（右））と従来手法で検出される亜硝酸還元酵素遺伝子の系統とそれを保有する微生物分類群（拡大画像↗）

図３　陸域環境中の本研究の手法により検出された亜硝酸還元酵素遺伝子と従来手法で検出された亜硝酸還元酵素遺伝子の数（エラーバーは標準偏差、n=3）（拡大画像↗）

自然生態系や農耕地からの窒素の損失や排水処理系における窒素除去は、主に微生物による脱窒作用によるものです（図１）。そのため脱窒微生物の分布や生理・生態は自然科学だけでなく農業や産業の分野においても多くの注目を集めてきました。また脱窒の過程で生成するN₂Oは強力な温室効果ガスであり、オゾン層破壊作用も大きいことから近年は環境の分野においても広く注目されています。

環境中での脱窒微生物の分布や挙動は、環境中から脱窒に必須な遺伝子である亜硝酸還元酵素遺伝子を検出し、遺伝子定量や塩基配列情報を得ることにより把握され、多くの研究者が同様の手法で研究しています。しかし、近年の脱窒微生物のゲノム解析の結果、従来の手法では一部の亜硝酸還元酵素遺伝子しか検出されないことがわかってきました。このことは、多くの脱窒微生物が解析対象にされていなかったことを意味します。それゆえに脱窒微生物の挙動から実際の脱窒やN₂O生成の現象を十分に説明できないという事態がしばしば見られます。また近年、N₂O生成を脱窒微生物の挙動を制御することで抑制する試みが行われていますが、このような試みが不完全になる事態も予想されます。

そこで東京大学大学院農学生命科学研究科の磯部一夫助教と妹尾啓史教授らのグループは、既に明らかになっている遺伝子の塩基配列情報を収集・利用して、亜硝酸還元酵素遺伝子をPCR法（注５）により広く検出するための方法を開発しました（図２）。続いて本手法を用いて環境中の脱窒微生物の分布、系統、存在量を調べるために、畑土壌、水田土壌、森林土壌、湖堆積物から微生物DNAを取得し、そこに含まれる亜硝酸還元酵素遺伝子を塩基配列解読ならびに定量PCR法により解析しました。その結果、すべての環境においてこれまで検出されてきたより多様かつ2-6倍もの豊富な亜硝酸還元酵素遺伝子（脱窒微生物）が存在していることを明らかにしました（図２、３）。さらに本研究において新たに検出された亜硝酸酵素還元遺伝子が、N₂Oが活発に放出されている農耕地土壌において転写発現していることを確認しました。さらに農耕地土壌から分離した多数の脱窒微生物の生理試験と遺伝子解析の結果と併せて、今回新たに検出した亜硝酸還元酵素遺伝子を有する微生物の多くは、農耕地土壌において脱窒の最終生成物としてN₂Oを生成している可能性が高いことを示しました。

本研究において開発された手法は今後多くの研究で利用され、環境中の脱窒に関する研究の進展に大きく貢献する可能性があります。また、環境中でのN₂Oの生成や脱窒のより精確な推定ならびにN₂O生成抑制技術の開発に大きく貢献することが期待されます。

本研究は公益財団法人発酵研究所、科学研究費助成事業、生研センター基礎研究推進事業、農林水産業・食品産業科学技術研究推進事業、GRENE事業、土壌由来温室効果ガス・土壌炭素調査事業による支援を受けて行われました。