放線菌が持つチロシンニトロ化酵素の発見

ニトロ基（-NO₂）は、化学の分野では頻繁に用いられる有用な含窒素官能基である一方、生体内にはほとんど見られません。しかしながら、微生物が作り出す二次代謝産物（注１）の中にはニトロ基を持ついくつかの化合物が存在します。東京大学大学院農学生命科学研究科、石川県立大学生物資源工学研究所、JST CREST 大西グループの研究チームは、放線菌（注２）Streptomyces atratusが生産する天然物ルフォマイシンに着目し、その生合成機構の解明を目指しました。ルフォマイシンは、その構造中にアミノ酸の一種であるチロシンがニトロ化を受けた3-ニトロチロシンを有するため、チロシンをニトロ化する酵素の存在が予想されました。しかし、このような酵素はこれまで報告例がありませんでした。研究の結果、シトクロムP450酵素（注３）であるRufOが一酸化窒素（注４）を使ってチロシンのニトロ化反応を触媒することを明らかにしました。本研究は米国生化学分子生物学会 (ASBMB) のThe Journal of Biological Chemistry誌に掲載され、ASBMBの会員誌 ASBMB Todayにもトピックスとして取り上げられました。
（ ASBMB Today　Vol. 16, No. 11, p.11, December 2017
　http://www.asbmb.org/uploadedFiles/ASBMBToday/Content/Archive/ASBMBToday-2017-12.pdf）
　 本酵素は耐熱性・強度に優れたスーパーエンプラであるポリベンズイミダゾール（注５）のバイオ生産に利用されることが期待されます。

図１　ルフォマイシンの生合成におけるチロシンのニトロ化反応。 （拡大画像↗）

図２　RufOを利用した新たなポリベンズイミダゾールの合成手法。JST CREST大西グループでは、紙パルプなどの廃バイオマス資源を活用し、石油に依存しないバイオプラスチックの生産を目指している。（拡大画像↗）

抗結核薬のストレプトマイシンをはじめ、放線菌が作り出すさまざまな二次代謝産物は、人々の健康と社会の発展に大きく貢献してきました。今も放線菌は医薬品などの有用化合物の資源として注目され、その研究が精力的に行われています。一方で、化学的な視点から二次代謝産物を見てみると、その生合成には興味深い酵素反応が数多く見られることから、有機化学的、酵素学的見地からも重要な研究対象です。近年、化学工業の脱石油化や環境負荷の低減が盛んに叫ばれており、酵素反応を使った穏和な条件での物質変換が求められています。放線菌の二次代謝産物の生合成機構を理解し、ユニークな反応を触媒できる酵素を発見し、工業プロセスに応用することは、このようなグリーンケミストリーの推進に繋がると期待されます。
　 ニトロ基（-NO₂）は、生体内ではあまり見られない一方、二次代謝産物の中にはニトロ基を持つ化合物が報告されています。しかし、これらのニトロ基がどのように作られるのかは完全には解明されていません。本研究で着目したルフォマイシン (rufomycin) は、放線菌Streptomyces atratusが生産する環状ペプチドであり、結核菌に対して抗菌活性を示すことが報告された化合物です（図１）。ルフォマイシンの構造中にはチロシンにニトロ基が付いた3-ニトロチロシンが含まれていますが、ルフォマイシンの生合成機構は未解明であり、3-ニトロチロシンを合成する酵素はこれまで報告例がありませんでした。そこで東京大学大学院農学生命科学研究科、石川県立大学生物資源工学研究所、JST CREST 大西グループの研究チームは、ルフォマイシンの生合成機構を明らかにし、3-ニトロチロシンを合成する新たな酵素を同定することを目指しました。
　 過去の研究報告で、アミノ酸の一種であるトリプトファンをニトロ化するシトクロムP450酵素TxtEが発見されており、TxtEは一酸化窒素合成酵素TxtDが生産する一酸化窒素を利用してニトロ化反応を行うこと、txtE, txtD遺伝子はオペロン（注６）を形成していることが明らかにされていました。そこで、ルフォマイシンの生合成におけるチロシンのニトロ化酵素も、同様に一酸化窒素を使ってチロシンをニトロ化するのではないかと予想しました。まずS. atratusのドラフトゲノム解析を行い、ルフォマイシンの生合成に関わる遺伝子群を探索しました。その結果、シトクロムP450酵素 (RufO)、一酸化窒素合成酵素 (RufN) をコードする遺伝子が含まれる領域を発見しました。rufN, rufOはオペロンを構成していました。そこでRufOがチロシンニトロ化酵素の候補であると考え、解析を進めることにしました。
　 まず、RufOのルフォマイシン生合成への寄与を調べるため、rufO遺伝子破壊株 (ΔrufO) を作製しました。ΔrufO株ではルフォマイシンの生産が完全に消失しました。また、ニトロ基を持たないルフォマイシン類縁化合物の生産も見られませんでした。しかし、ΔrufO株の培地に3-ニトロチロシンを添加して培養を行うと、ルフォマイシンの生産は野生株と同程度にまで回復することがわかりました。この実験結果から、rufO遺伝子はルフォマイシンの生合成に必須であり、予想通りRufOは3-ニトロチロシンを合成する酵素であることが明らかになりました。次にRufO組換えタンパク質を調製し、試験管内でRufOによるチロシンのニトロ化反応を行ったところ、RufOによる3-ニトロチロシンの生成が確認されました。これらの実験結果から、RufOによるチロシンのニトロ化反応はペプチド骨格を構築する前に、遊離のチロシンに対して起こることが強く示唆されました（図１）。
　 本研究で発見したRufOは、ベンゼン環にニトロ基を直接導入する初めての酵素です。この機能を応用すると、有用なプラスチック材料をバイオの力で作れるようになる可能性があります。強度・耐熱性に優れるポリベンズイミダゾールは、ベンゼン環上で2つのアミノ基が隣り合った芳香族ジアミン化合物を原料として合成されます（図２）。しかしながら、このような芳香族ジアミン化合物は生物界からは発見されておらず、現在その原料は石油に依存しています。一方、3-ニトロチロシンのように、ベンゼン環上で水酸基とニトロ基が隣り合った化合物にスマイルス転位反応（注７）を行うと、芳香族ジアミン化合物に容易に変換することができます。すなわち、RufOの能力を応用すれば、石油由来ではないポリベンズイミダゾールを合成できるようになる可能性があります。本研究グループの大西康夫教授が代表を務めるJST CRESTプロジェクト「高性能イミダゾール系バイオプラスチックの一貫生産プロセスの開発」では、このようにバイオの力と化学の力を融合させた新しいバイオプラスチック生産プロセスの開発研究に取り組んでいます。