発表者
冨田 宏矢(東京大学大学院 農学生命科学研究科 応用生命工学専攻 学振特別研究員 (PD))
勝山 陽平(東京大学大学院 農学生命科学研究科 応用生命工学専攻 准教授)
南 博道 (石川県立大学 生物資源工学研究所 准教授)
大西 康夫(東京大学大学院 農学生命科学研究科 応用生命工学専攻 教授、JST CREST研究代表者)

発表のポイント

◆抗結核菌活性がある天然化合物ルフォマイシンの生合成遺伝子群を同定し、長い間未解明であった生合成機構の一端を解明しました。

◆これまで報告がなかったチロシンのニトロ化酵素を発見し、この酵素がルフォマイシンの合成に必須であることを明らかにしました。

◆チロシンニトロ化酵素は微生物を用いた有用物質生産の新しいツールとして期待できます。

発表概要

ニトロ基(-NO2)は、化学の分野では頻繁に用いられる有用な含窒素官能基である一方、生体内にはほとんど見られません。しかしながら、微生物が作り出す二次代謝産物(注1)の中にはニトロ基を持ついくつかの化合物が存在します。東京大学大学院農学生命科学研究科、石川県立大学生物資源工学研究所、JST CREST 大西グループの研究チームは、放線菌(注2)Streptomyces atratusが生産する天然物ルフォマイシンに着目し、その生合成機構の解明を目指しました。ルフォマイシンは、その構造中にアミノ酸の一種であるチロシンがニトロ化を受けた3-ニトロチロシンを有するため、チロシンをニトロ化する酵素の存在が予想されました。しかし、このような酵素はこれまで報告例がありませんでした。研究の結果、シトクロムP450酵素(注3)であるRufOが一酸化窒素(注4)を使ってチロシンのニトロ化反応を触媒することを明らかにしました。本研究は米国生化学分子生物学会 (ASBMB) のThe Journal of Biological Chemistry誌に掲載され、ASBMBの会員誌 ASBMB Todayにもトピックスとして取り上げられました。
( ASBMB Today Vol. 16, No. 11, p.11, December 2017
 http://www.asbmb.org/uploadedFiles/ASBMBToday/Content/Archive/ASBMBToday-2017-12.pdf
  本酵素は耐熱性・強度に優れたスーパーエンプラであるポリベンズイミダゾール(注5)のバイオ生産に利用されることが期待されます。

発表内容

図1 ルフォマイシンの生合成におけるチロシンのニトロ化反応。 (拡大画像↗

図2 RufOを利用した新たなポリベンズイミダゾールの合成手法。JST CREST大西グループでは、紙パルプなどの廃バイオマス資源を活用し、石油に依存しないバイオプラスチックの生産を目指している。(拡大画像↗

抗結核薬のストレプトマイシンをはじめ、放線菌が作り出すさまざまな二次代謝産物は、人々の健康と社会の発展に大きく貢献してきました。今も放線菌は医薬品などの有用化合物の資源として注目され、その研究が精力的に行われています。一方で、化学的な視点から二次代謝産物を見てみると、その生合成には興味深い酵素反応が数多く見られることから、有機化学的、酵素学的見地からも重要な研究対象です。近年、化学工業の脱石油化や環境負荷の低減が盛んに叫ばれており、酵素反応を使った穏和な条件での物質変換が求められています。放線菌の二次代謝産物の生合成機構を理解し、ユニークな反応を触媒できる酵素を発見し、工業プロセスに応用することは、このようなグリーンケミストリーの推進に繋がると期待されます。
  ニトロ基(-NO2)は、生体内ではあまり見られない一方、二次代謝産物の中にはニトロ基を持つ化合物が報告されています。しかし、これらのニトロ基がどのように作られるのかは完全には解明されていません。本研究で着目したルフォマイシン (rufomycin) は、放線菌Streptomyces atratusが生産する環状ペプチドであり、結核菌に対して抗菌活性を示すことが報告された化合物です(図1)。ルフォマイシンの構造中にはチロシンにニトロ基が付いた3-ニトロチロシンが含まれていますが、ルフォマイシンの生合成機構は未解明であり、3-ニトロチロシンを合成する酵素はこれまで報告例がありませんでした。そこで東京大学大学院農学生命科学研究科、石川県立大学生物資源工学研究所、JST CREST 大西グループの研究チームは、ルフォマイシンの生合成機構を明らかにし、3-ニトロチロシンを合成する新たな酵素を同定することを目指しました。
  過去の研究報告で、アミノ酸の一種であるトリプトファンをニトロ化するシトクロムP450酵素TxtEが発見されており、TxtEは一酸化窒素合成酵素TxtDが生産する一酸化窒素を利用してニトロ化反応を行うこと、txtE, txtD遺伝子はオペロン(注6)を形成していることが明らかにされていました。そこで、ルフォマイシンの生合成におけるチロシンのニトロ化酵素も、同様に一酸化窒素を使ってチロシンをニトロ化するのではないかと予想しました。まずS. atratusのドラフトゲノム解析を行い、ルフォマイシンの生合成に関わる遺伝子群を探索しました。その結果、シトクロムP450酵素 (RufO)、一酸化窒素合成酵素 (RufN) をコードする遺伝子が含まれる領域を発見しました。rufN, rufOはオペロンを構成していました。そこでRufOがチロシンニトロ化酵素の候補であると考え、解析を進めることにしました。
  まず、RufOのルフォマイシン生合成への寄与を調べるため、rufO遺伝子破壊株 (ΔrufO) を作製しました。ΔrufO株ではルフォマイシンの生産が完全に消失しました。また、ニトロ基を持たないルフォマイシン類縁化合物の生産も見られませんでした。しかし、ΔrufO株の培地に3-ニトロチロシンを添加して培養を行うと、ルフォマイシンの生産は野生株と同程度にまで回復することがわかりました。この実験結果から、rufO遺伝子はルフォマイシンの生合成に必須であり、予想通りRufOは3-ニトロチロシンを合成する酵素であることが明らかになりました。次にRufO組換えタンパク質を調製し、試験管内でRufOによるチロシンのニトロ化反応を行ったところ、RufOによる3-ニトロチロシンの生成が確認されました。これらの実験結果から、RufOによるチロシンのニトロ化反応はペプチド骨格を構築する前に、遊離のチロシンに対して起こることが強く示唆されました(図1)。
  本研究で発見したRufOは、ベンゼン環にニトロ基を直接導入する初めての酵素です。この機能を応用すると、有用なプラスチック材料をバイオの力で作れるようになる可能性があります。強度・耐熱性に優れるポリベンズイミダゾールは、ベンゼン環上で2つのアミノ基が隣り合った芳香族ジアミン化合物を原料として合成されます(図2)。しかしながら、このような芳香族ジアミン化合物は生物界からは発見されておらず、現在その原料は石油に依存しています。一方、3-ニトロチロシンのように、ベンゼン環上で水酸基とニトロ基が隣り合った化合物にスマイルス転位反応(注7)を行うと、芳香族ジアミン化合物に容易に変換することができます。すなわち、RufOの能力を応用すれば、石油由来ではないポリベンズイミダゾールを合成できるようになる可能性があります。本研究グループの大西康夫教授が代表を務めるJST CRESTプロジェクト「高性能イミダゾール系バイオプラスチックの一貫生産プロセスの開発」では、このようにバイオの力と化学の力を融合させた新しいバイオプラスチック生産プロセスの開発研究に取り組んでいます。

発表雑誌

雑誌名
:「The Journal of Biological Chemistry」
論文タイトル
:Identification and characterization of a bacterial cytochrome P450 monooxygenase catalyzing the 3-nitration of tyrosine in rufomycin biosynthesis
著者
:Hiroya Tomita, Yohei Katsuyama, Hiromichi Minami, Yasuo Ohnishi
DOI番号
:10.1074/jbc.M117.791269
論文URL
http://www.jbc.org/content/292/38/15859.full
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問い合わせ先

東京大学大学院農学生命科学研究科 応用生命工学専攻 醗酵学研究室
教授 大西 康夫 (おおにし やすお)
Tel:03-5841-5123
Fax:03-5841-8021
准教授 勝山 陽平 (かつやま ようへい)
Tel: 03-5841-5124
Fax: 03-5841-8021
研究室URL:http://park.itc.u-tokyo.ac.jp/hakko/
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用語解説

注1 二次代謝産物
生物が作り出す多種多様な物質のうち、生命活動に必須なもの(アミノ酸、糖質など)を一次代謝産物、必須ではないものを二次代謝産物と呼ぶ。抗生物質は代表的な二次代謝産物である。
注2 放線菌
真正細菌の一群で、放射状の菌糸を形成して増殖することから名付けられた。このような形態学的な特徴に加え、多くの二次代謝産物を作り出す能力を持つ。放線菌が生産するさまざまな抗生物質は、医療現場で欠かせないものになっている。
注3 シトクロムP450酵素
酸化還元酵素ファミリーの一つで、ヘム鉄を補因子として利用することでさまざまな酸化反応を触媒する。動物、植物、微生物など多岐にわたって分布しており、薬物代謝や二次代謝産物の生合成などで重要な役割を果たす。
注4 一酸化窒素
化学式NOで表される無機化合物。生体内では主に一酸化窒素合成酵素によって作られ、シグナル伝達に関与する。動脈を拡張させて血流量を増やす性質があるため、これを利用した心臓病治療薬が利用されている。窒素酸化物(NOx)の一種であり、大気汚染の原因物質の一つ。
注5 ポリベンズイミダゾール
ベンズイミダゾール環を持つ高性能なスーパーエンジニアリングプラスチック(スーパーエンプラ)。強度、耐熱性などに優れる。
注6 オペロン
遺伝子の転写において、同時に発現が制御され、同一のmRNAに転写される複数の遺伝子を持つゲノム上の領域。オペロンを構成する遺伝子群は、協同して同じ機能を果たすことが多い。一般的に原核生物において見られ、真核生物では見られない。
注7 スマイルス転位反応
有機化学分野における転位反応の一つ。
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