東京大学大学院 農学生命科学研究科 研究成果

ニトロソ基を有する化合物にはクスリになる可能性をもつものが少なからず報告されていますが、天然においてニトロソ基が形成される仕組みは長年不明でした。今回、バクテリアの一種である放線菌から、芳香族アミノ基をニトロソ基に変換する酸化酵素を世界に先駆けて発見しました。

ニトロソ基（注1）を有する化合物にはクスリになる可能性をもつものが少なからず報告されています。例えば、バクテリアの一種である放線菌が生産するフェロベルディン（注2）には、悪玉コレステロールの蓄積を抑制する効果があることが示されています。しかしながら、天然においてニトロソ基が形成される仕組みはこれまで全くわかっていませんでした。我々は放線菌ストレプトミセス・ムラヤマエンシスが生産する4-ヒドロキシ-3-ニトロソベンズアミド（4,3-HNBAm）という芳香族C-ニトロソ化合物（注3）の全生合成経路を解明し、ニトロソ化を触媒する酵素を世界に先駆けて発見しました。

4,3-HNBAmは3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸（3,4-AHBA）という化合物から作られることが、海外のグループの研究によって予想されていました。一方、我々の研究グループは3,4-AHBAから作られる別の構造の化合物の全生合成経路の解明に取り組み、3,4-AHBA合成酵素を発見していました。我々はストレプトミセス・ムラヤマエンシスにおける4,3-HNBAmの生合成においても、この3,4-AHBA合成酵素と似た酵素が働いていると予想し、この酵素遺伝子の配列を手がかりにして、4,3-HNBAm生合成酵素遺伝子クラスター（注4）を取得することに成功しました。3,4-AHBA合成を担うと考えられた2つの酵素遺伝子（nspI、nspHと命名）を、3,4-AHBA合成能をもたない放線菌に導入したところ、予想通り3,4-AHBAが生産されました。さらに、これらに加え、その下流にコードされていた3つの遺伝子（nspE、nspF、nspNと命名）を導入したところ、目的の化合物である4,3-HNBAmが生産されました。以上のことから、3,4-AHBAから4,3-HNBAmへの変換は、nspE、nspF、nspNという遺伝子から作られる3種のタンパク質（NspE、NspF、NspN）が担っていることがわかりました。

NspNはそのアミノ酸配列情報からアミド基転移酵素（注5）であると推定されました。組換え体酵素を用いて試験管内反応を行ったところ、NspNは3,4-AHBAをアミド化し、3-アミノ-4-ヒドロキシベンズアミド（3,4-AHBAm）を生成しました。一方、アミノ酸配列情報から、NspFはチロシナーゼ（注6）ファミリーの銅含有酸化酵素、NspEはNspFに銅を供給する補因子であると推定され、NspFがニトロソ化に関与していると予想しました。銅を添加して活性化させた組換え体NspFを用いて試験管内反応を行ったところ、NspFは3,4-AHBAmのアミノ基を酸化してニトロソ基に変換し、4,3-HNBAmを生成しました。

このようにして、4,3-HNBAmの全生合成経路（添付資料参照）を明らかにしましたが、ニトロソ化合物のニトロソ基形成に関わる酵素の同定は本研究が初めてです。我々の研究グループは、以前、チロシナーゼファミリーの銅含有酸化酵素GriFが、フェノキサジノン骨格形成に関与する新規な2-アミノフェノール酸化酵素であることを報告しましたが、今回、同じファミリーに属するNspFがニトロソ化を触媒できることを明らかにしたことにより、チロシナーゼファミリーに属する酵素が多様な触媒機能を有していることが示されました。今後、NspFを利用することにより、クスリになる可能性のある新しい芳香族C-ニトロソ化合物を微生物で生産させることが可能になると期待されます。

本研究は以下の研究費のサポートを受けました。
●文部科学省科研費基盤研究（C）（課題番号19580082「3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸を前駆体とする化合物の生合成遺伝子群の解析」）：4,3-HNBAm生合成遺伝子クラスターの取得
●NEDO「微生物機能を活用した環境調和型製造基盤技術開発／微生物機能を活用した高度製造基盤技術開発」プロジェクト（研究テーマ名「放線菌の活用による新規二次代謝産物の開発」）：異種発現による4,3-HNBAm生合成遺伝子クラスターの解析、酵素反応解析
●文部科学省ターゲットタンパク研究プログラム（課題名「抗生物質やその他の有用物質生産に利用可能な鍵酵素の構造・機能解析」）： GriFおよびNspFの触媒機能の詳細な解析、両酵素の大量発現・精製系の構築

雑誌： Nature Chemical Biology
著者： Akio Noguchi, Takeshi Kitamura, Hiroyasu Onaka, Sueharu Horinouchi and Yasuo Ohnishi
題名： A copper-containing oxidase catalyzes C-nitrosation in nitrosobenzamide biosynthesis
2010年8月1日　オンライン版公開

東京大学大学院農学生命科学研究科 応用生命工学専攻
醗酵学研究室
大西 康夫　教授
Tel： 03-5841-5126
Fax： 03-5841-8021
E-mail: ayasuo@mail.ecc.u-tokyo.ac.jp

（注1）ニトロソ基：

-NOで表される置換基。ニトロソ基をもつ有機化合物をニトロソ化合物という。

（注2）フェロベルディン（ferroverdin）:

天然では珍しい緑色色素として1955年に発見された化合物。パラ位置換オルトニトロソフェノール3分子が2価鉄をキレートして生成される。天然より最初に発見された芳香族C-ニトロソ化合物である。本研究の対象である4,3-HNBAmなど、パラ位置換オルトニトロソフェノール化合物は放線菌から多数単離されている。

（注3）芳香族C-ニトロソ化合物：

ニトロソ基が直接芳香環に結合した芳香族化合物。

（注4）生合成遺伝子クラスター：

放線菌などのバクテリアや糸状菌においては、抗生物質などの生合成に必要な酵素遺伝子群は、染色体DNA（あるいはプラスミドDNA）上の1カ所にまとまってコードされているケースがほとんどであり、この遺伝子群を生合成遺伝子クラスターと呼ぶ。

（注5）アミド基転移酵素：

基質のカルボキシル基にアミノ基を転移し、アミド基を生成する反応を触媒する酵素。アミノ基供与体としては、主にグルタミンやアンモニアが用いられる。

（注6）チロシナーゼ：

チロシンなどのモノフェノール化合物を酸化し、ジフェノール化合物を生成する反応を触媒する（クレゾラーゼ活性）。生成物のオルトジフェノール化合物はさらにチロシナーゼによって酸化され、オルトキノンを生成する（カテコラーゼ活性）。活性中心に2つの銅原子を有し、これらが分子状酸素を活性化することで反応が進行する。