東京大学大学院 農学生命科学研究科 研究成果

特定のDNA配列と結合するDNA切断酵素タンパク質（ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN））を利用した新規の遺伝子操作技術により、植物の染色体上の特定の遺伝子を破壊した植物体の作出に、世界で初めて成功しました。この技術により、これまで偶発的に得ていた変異体を計画的に作成することが可能となり、植物の基礎研究並びに突然変異育種に大きく貢献することが期待されます。

植物の品種改良の主な方法に突然変異育種があります。この方法では、偶然得られる突然変異体から目的の特性を持つものを探しますが、突然変異の頻度が低いことに加えて、目的とする形質を持つ突然変異体が見つかるとは限りません。しかし、どの遺伝子を破壊すればどのような表現型を示すかがあらかじめ分かっているか、推定できる場合は、狙いを定めて標的とする遺伝子のみを破壊できれば、育種の効率は大きく向上すると期待されます。

近年、特定のDNA塩基配列に特異的に結合するジンクフィンガータンパク質（注１）とDNAを切断するヌクレアーゼタンパク質を組み合わせたZFNにより、染色体上の標的遺伝子を特異的に切断する技術が、ショウジョウバエ・哺乳動物において報告されました。本研究ではモデル植物シロイヌナズナにZFN技術を活用し、特定の遺伝子を破壊した突然変異体を計画的に作出することが可能であることを示しました。

本研究では標的遺伝子に、植物ホルモンのアブシジン酸（ABA）（注２）応答に関わる遺伝子ABA INSENSITIVE 4 (ABI4)遺伝子を選び、シロイヌナズナ植物体内でABI4を特異的に切断するZFNを一過的に発現させたところ、処理植物体の次世代で、ABI4遺伝子が特異的に破壊された植物体を見出すことに成功しました(図１)。また、得られた突然変異体は既知のABI4突然変異体の特徴である高濃度のABAとグルコース処理に抵抗性を示しました（図２A, B）。さらに私たちは、DNA修復因子のひとつであるKu80の変異体内でZFNを作用させることによって、切断部位により大きな欠失が誘導できることを明らかにしました（図３）。このことは、ZFNとDNA修復システムの制御により、標的遺伝子に、質的に異なる変異を導入できることを示しており、例えば、不要な遺伝子を完全に削除することも可能になると考えられます。

今回開発した方法は、対象が形質転換可能な植物であり、かつZFNが設計できる遺伝子であるならば、どの植物にも使用可能だと考えられます。この技術は農業上や食品として望ましくない遺伝子、環境ストレス耐性やバイオマス増産の抑制因子の破壊・除去することに役立つと考えられます。

図１．ZFNのゲノム切断によるABI4遺伝子上に誘発された突然変異 zfn_abi4-1-1は、ZFNによるゲノム切断により、ABI4遺伝子上に特異的な変異が新たに確認された変異株です。ZFNの認識配列領域に1塩基欠失が生じて、ABI4遺伝子の159番目のバリン残基がストップコドンへと変化しました。	図２．得られたABI4の突然変異体における高濃度のABAおよびグルコース耐性 zfn_abi4-1-1変異株の種子発芽は、既存のABI4突然変異株（abi4）と同様に、高濃度のABA (A) およびグルコース(Glu, B)に対して非感受性を示しました（WTは野生株）。
図３．DNA修復因子ku80変異株と野生型のシロイヌナズナにZFNを作用させた際の遺伝子配列の変化 ku80シロイヌナズナ変異株を用いてZFNを作用させ、ABI4遺伝子上の変異を調べた結果、ku80遺伝子の変異の影響により切断部位に、より大きな欠失が誘導できることが明らかとなりました。

・Keishi Osakabe, Yuriko Osakabe and Seiichi Toki
Site-directed mutagenesis in Arabidopsis using custom-designed zinc-finger nucleases.
Proc. Nat. Acad. Sci. USA (2010) June 29, 107(26): 12034-12039.

・Holger Puchta and Barbara Hohn
Commentary
Breaking news: Plants mutate right on target
Proc. Nat Acad. Sci USA (2010) June 29, 107(26): 11657-11658.
（上記の論文の紹介文です）

タンパク質構造の中のファミリーの一つで、DNAに結合する性質を持つ。構造中の特定のアミノ酸配列に亜鉛分子が会合しています。

乾燥などの水分ストレスに応答し植物体内に合成される植物ホルモンの一種。種子の発達と成熟、種子休眠や冬眠芽の誘導、気孔の開閉や乾燥耐性の獲得に重要な遺伝子の発現を誘導します。ABA INSENSITIVE 4は、こうした遺伝子の発現制御を担っている転写因子の一つ。