東京大学 農学生命科学研究科 プレスリリース

◆どのような成果を出したのか

イネの主要な抗菌性化合物である “サクラネチン”の生合成を担う鍵酵素遺伝子OsNOMTを発見した。

◆新規性（何が新しいのか）

これまで、イネにおけるサクラネチン合成の最終段階を担う酵素の存在は示唆されていたが、ゲノム情報が利用可能な今日においても、その構造遺伝子は同定されていなかった。

◆社会的意義／将来の展望

本発見により生理活性フラボノイドサクラネチンの大量生産およびイネの耐病性増強への効果が見込まれ、さらに将来的にはサクラネチン強化米の作出につながることが期待される。

東京大学生物生産工学研究センター清水崇史研究員および岡田憲典助教らの研究グループは、イネの主要な抗菌性化合物「サクラネチン」の生合成を担う鍵酵素遺伝子OsNOMTを初めて発見した。

サクラネチンは、イネの病原菌に対して抗菌性を示すだけでなく、ヒトを含む動物に生理活性を示し医薬品への応用も期待されている。しかし、病原菌感染時に微量しか合成されないサクラネチン合成酵素を精製することが難しく、その生合成に必要な遺伝子の同定はこれまで成されていなかった。

今回、東京大学の研究グループは、サクラネチン合成酵素の精製およびアミノ酸配列の解読に成功し、長年不明であったサクラネチン生合成の最終段階を担う遺伝子OsNOMTを同定した。OsNOMT遺伝子の発見により、様々な薬理効果が報告されているサクラネチンの微生物生産が可能となり、また、将来的にはサクラネチンの含有量を高めたイネを育種することで、病原菌耐性の増強と共に、サクラネチン強化米の作出につながることが期待される。

イネの主要なフラボノイド型のファイトアレキシン（注１）として知られるサクラネチンは、イネいもち病菌に対する抗菌活性を保持する化合物であり、病原菌の感染などによって誘導的に生産される抗菌性化合物です。1907年に桜の樹皮から配糖体として単離されたのが最初の報告で、その後、イネやその他の植物にも含まれることが確認されており、その存在は古くから知られておりました。このサクラネチンは、イネの病原菌に対して抗菌性を示すだけでなく、ヒトを含む動物に対しても、脂肪細胞誘導効果や抗炎症効果があるなど医薬品としても有用である可能性が示唆されています。イネでは、様々なフラボノイドの基質であるナリンゲニンの7位がナリンゲニン７-O-メチルトランスフェラーゼ（OsNOMT）によってメチル化されてサクラネチンが生合成されることが以前から示唆されており、その遺伝子を特定する試みはこれまでも行われてきましたが、その取得には至っておりませんでした。

以前の研究で、イネ野生型株の葉身をUV処理しサクラネチン生産を誘導した材料からOsNOMT活性を指標に酵素精製が行われました。しかし、得られた酵素のアミノ酸配列に相当するイネ遺伝子の組換えタンパク質を用いた酵素活性測定からはOsNOMT活性が認められず、そのかわりにナリンゲニンではなくコーヒー酸の3位をメチル化してフェルラ酸を合成するコーヒー酸3-O-メチルトランスフェラーゼ（OsCOMT1）が得られていました。これは、イネに常時多量に存在するOsCOMT1が、病原菌感染時に微量にしか合成されないサクラネチン合成酵素OsNOMTの精製の妨げになってしまったためと考えられました。

図１　様々な薬理効果を保持するサクラネチンの生合成最終段階。OsNOMT遺伝子は基質となるナリンゲニンの7位を特異的にメチル化するメチルトランスフェラーゼをコードする。 （拡大画像↗）

そこで、イネoscomt1変異株を利用してOsNOMTを精製することを試みました。oscomt1変異体の葉身をUV処理し粗タンパク質を調製、硫安塩析を行った後、イオン交換カラム、アデノシンアガロースを担体としたメチルトランスフェラーゼに対するアフィニティーカラムの２つのカラムを用いることで順次精製を進めOsNOMT活性を400倍にまで濃縮することに成功しました。得られた精製タンパク質からは、精製ステップを経ることで新たに出現する約40kDaのタンパク質が確認されました。この40kDaのタンパク質をMALDI-TOF/TOF装置（注２）で分析することでアミノ酸配列を取得し、得られたアミノ酸データの解析から機能未知である2種のO-メチルトランスフェラーゼ様遺伝子が特定されました。これら2種の遺伝子を用いてGST融合タンパク質として大腸菌内で発現させ組換えタンパク質を精製し、得られたタンパク質を用いたサクラネチン合成活性測定を行うことで、最終的にはその内のひとつであるOs12g0240900遺伝子がサクラネチン合成に必要なOsNOMT遺伝子であることを実験的に証明することができました。こうして、長年にわたり不明であったサクラネチン生合成の最終ステップが明らかにされました（図１）。GST-OsNOMT組換えタンパク質を用いた動力学的解析を行ったところ、基質ナリンゲニンに対するKm値（注３）は約1.9 μMとなり、イネ葉身をジャスモン酸処理した場合に蓄積するナリンゲニンの内生濃度約1.8 μMと良く一致することが示されました。さらに、本酵素の基質特異性をナリンゲニン以外のフラボノイド類を基質として用いた酵素反応により解析したところ、ナリンゲニンと類似の構造を持つカンフェロール、アピゲニン、ルテオリンに対するメチル基転移活性を保持するもののナリンゲニンに対する活性が一番高いことが示されました。一方、OsCOMT1の基質と考えられるコーヒー酸を含むフェノール性化合物やイソフラボノイド類に対する活性は認められませんでした。OsNOMTの転写レベルでの発現は、ジャスモン酸処理後6時間で最大となるような誘導性を示し、また、いもち菌接種後にも基質ナリンゲニンとサクラネチンの蓄積を伴ってOsNOMT遺伝子の発現が誘導を受けることが示されました。これらの一連の結果は、OsNOMTがイネにおいて病害応答時に誘導的に生産されるサクラネチンの合成を担う遺伝子であることを示唆するものです。今後、OsNOMT遺伝子の発現抑制株の作出などを通して、OsNOMT遺伝子がイネにおける唯一のサクラネチン合成酵素遺伝子であるかどうかが明らかにされるものと思われます。

冒頭で述べたように、サクラネチンは人にとって利用価値の高い様々な生理活性を有することが示されていますので、機能性食品への添加や医薬品への応用の可能性も大いに考えられます。今回イネから取得されたOsNOMT遺伝子を利用することで、生理活性フラボノイドサクラネチンのバクテリアや酵母を用いた大量生産が可能となるだけでなく、将来的にはサクラネチンの含有量を高めたイネを育種することで、病原菌に感染しにくい病害抵抗性イネの育種や、サクラネチンを米に蓄積させたサクラネチン強化米の作出につながることが期待されます。

雑誌名

Journal of Biological Chemistry （６月1日号）

論文タイトル

Purification and identification of naringenin 7-O-methyltransferase, a key enzyme in the biosynthesis of the flavonoid phytoalexin sakuranetin in rice.

著者

Takafumi Shimizu, Fengqiu Lin, Morifumi Hasegawa, Kazunori Okada, Hideaki Nojiri, Hisakazu Yamane.

アブストラクト

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22493492

東京大学生物生産工学研究センター　環境保全工学研究室
助教　岡田憲典
Tel: 03-5841-3070
Fax: 03-5841-3070
E-mail: ukokada@mail.ecc.u-tokyo.ac.jp

（注１）　ファイトアレキシン

健全な植物には存在せず、病原菌の感染やUV照射、重金属ストレスなどにより誘導的に生産される抗菌性二次代謝産物の総称。イネにはフラボノイドタイプのサクラネチンと、4種の環状ジテルペンタイプ、モミラクトン類・ファイトカサン類・オリザレキシン類・オリザレキシンSの存在が知られている。

（注２）　MALDI-TOF/TOF装置

マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（MALDI）は質量分析におけるサンプルのイオン化法の一つであり、TOF型（Time of Flight、飛行時間質量分析計） の分析部が組み合わされることで、生成したイオンは加速電圧（20～25kV前後）を印加されて運動エネルギーを生じ、イオン検出器まで飛行していく。イオンが 受け取るエネルギーは電荷量のみに依存する為、電荷に対する質量（質量電荷比）が大きい分子は低速で、逆に小さい分子は高速で飛行する。この差異により、 検出器に到達するまでの時間差からサンプルの質量を割り出す事が可能となる。この質量分析部をタンデムにつないだTOF/TOFによって、アミノ酸のつながったペプチドの質量を精密に分析し、そのペプチドにおけるアミノ酸配列を明らかにすることができる。

（注３）　Km値

「ミカエリス・メンテン定数」と呼ばれる。ミカエリス・メンテン定数とは、酵素と基質の親和性を表すパラメータであり、実測値としては酵素の最大速度の2分の1の反応速度 (Vmax/2) を有する基質濃度の値のこと。酵素反応の特性を表すのに使われる。Km値が小さければ、その酵素の反応は基質濃度が低いところで最大になることから、酵素と基質の結合が強い事を示す。