微生物によるバイオ燃料生産の鍵となる酵素のしくみを解明 － 酸化的セルロース分解の「ミッシングリンク」 －

これまで微生物によるセルロースの分解には主に加水分解酵素（セルラーゼ：注３）が関わるとされていましたが、近年、その効率を飛躍的に増大させる酸化的セルロース分解酵素の存在が注目されています。セルロースがこれらの酵素により分解されると、セロビオン酸ができますが（図１）、それがどのように代謝されるかは全く分かっていませんでした。そのような状況のもと、２０１３年に新しい酵素「セロビオン酸ホスホリラーゼ（CBAP）」が新潟大学大学院自然科学研究科の中井博之准教授らの研究グループにより発見されました。CBAPがセロビオン酸に作用すると、発酵に利用されやすい化合物に分解されます。この酵素は微生物による酸化的セルロース分解と発酵の代謝経路をつなぐ、いわば「ミッシングリンク（失われた環）」のような存在であることが解明されていました。
　今回、東京大学大学院農学生命科学研究科の伏信進矢教授らの研究グループは、中井准教授らと共同で、CBAPの立体構造をX線結晶構造解析（注４）により初めて解明しました（図２）。セロビオン酸と結合した状態のCBAPの構造を決定し（図３）、その作用メカニズムを詳細に明らかにしました。
　本成果は、学術的に興味深い結果がえられただけでなく、微生物を利用してセルロースを分解し、エタノールなどのバイオ燃料や様々な化合物を発酵生産する「バイオリファイナリー」（注５）の技術開発においても、重要な情報をもたらしました。

図１　微生物の酵素による酸化的セルロース分解とCBAPの反応
セルラーゼ（加水分解酵素）にはセルロース鎖を両端から切断するセロビオヒドロラーゼ（CBH）、セルロース鎖を中ほどから切断するエンドグルカナーゼ（EG）が含まれる。酸化酵素である溶解性多糖モノオキシゲナーゼ（LPMO）とセロビオース脱水素酵素（CDH）は電子を受け渡すことにより協同的に作用すると考えられている。LPMOにより生じた切断箇所には、セルラーゼがとりつきやすくなる。酵素の名前を青字で示し、酸化により生じた部分をマゼンタで表した。（拡大画像↗）

図２　CBAPの全体構造
CBAPは二つの酵素分子が結合した二量体の状態で存在する。左半分の色のついた部分と、右半分の灰色の部分がそれぞれ一つの酵素分子。CBAPに結合したセロビオン酸と硫酸イオン（リン酸類似化合物）は球で表した。（拡大画像↗）

図３　CBAPの触媒部位の構造
セロビオン酸はグルコース部分（灰色）とグルコン酸部分（マゼンタ）に分けられる。CBAPのアミノ酸残基を緑色で表した。セロビオン酸の切断には、リン酸と４２７番目のアスパラギン酸が関わり、グルコン酸部分の結合には、６０９番目のアルギニン、６１３番目のリジン、１９０番目のグルタミンが関わる。（拡大画像↗）

植物の細胞壁の約半分を占めるセルロースは地球上で最も豊富に存在する有機物であり、澱粉や蔗糖などの可食性の生物資源（バイオマス）と競合しない再生可能な生物資源として大規模な利用が望まれています。セルロースを分解する酵素として、微生物が作る一群の加水分解酵素（セルラーゼ）が古くから研究されていましたが、近年、溶解性多糖モノオキシゲナーゼ（LPMO：注６）と呼ばれる新たな酵素が発見されて注目を浴びています。LPMOは非常に硬い固体であるセルロースの表面にとりつき、酸素を利用して切断することによりその表面に「引っかき傷」を作り、セルラーゼが作用しやすくなります（図１）。従って、LPMOはセルラーゼの活性を飛躍的に増強する「ブースター」として利用されています。このような酸化酵素とセルラーゼが働いて生成する主な産物はセロビオン酸ですが、セルロースを分解する微生物が、セロビオン酸をどのようにして代謝し、エタノールなどの発酵へと導いているかは全く分かっていませんでした。そのような状況のもと、２０１３年に、新潟大学大学院自然科学研究科の中井博之准教授、農研機構食品総合研究所食品バイオテクノロジー研究領域の北岡本光上席研究員、東京大学大学院農学生命科学研究科の五十嵐圭日子准教授らの研究グループにより、この酸化的セルラーゼ分解と発酵経路の「ミッシングリンク（失われた環）」にあたる酵素「セロビオン酸ホスホリラーゼ（CBAP）」が発見されました。CBAPはセロビオン酸にリン酸を付加しながら切断し（加リン酸分解）、グルコース１−リン酸とグルコン酸を生成します。これらの産物は、解糖系やペントースリン酸回路といったよく知られている代謝経路に入ります。従って、CBAPは微生物の酸化的セルロース分解と発酵の２つの経路をつなぐ鍵酵素であると言えます。しかし、CBAPの立体構造は分かっておらず、この酵素がどのようにして基質を結合し、反応を触媒しているのかは不明でした。

今回、東京大学大学院農学生命科学研究科の伏信進矢教授の研究グループが中心となり、CBAPの高分解能の三次元構造を、X線結晶構造解析の技術を用いて初めて明らかにしました（図２）。また、決定された構造を基に点変異体（注７）を用いた機能解析を行い、CBAPの基質認識と反応のメカニズムを解明しました。

本研究では、米国チェサピーク湾から単離されたセルロース分解能力を持つ海洋性細菌（サッカロファガス・デグラダンス）から、CBAPの遺伝子を取得して実験に用いました。本研究グループは、高エネルギー加速器研究機構（KEK）物質構造科学研究所のフォトンファクトリー（注８）のBL‐17AとNW-12Aを利用して、セロビオン酸と硫酸イオン（リン酸の類似化合物）が結合した状態（図３）を含めて４種類の結合状態の構造を明らかにしました。セロビオン酸の結合部位のうち、グルコース部分の結合に関わる部分は他の類似酵素と似ていましたが、グルコン酸部分の結合に関わる部分は全く新しい構造であることが分かりました。さらに、点変異体を用いた機能解析を行なった結果、グルコン酸結合部位に存在する６０９番目のアルギニン、６１３番目のリジン、そして１９０番目のグルタミンが、基質の結合に重要な役割を担っていることが明らかになりました。また、グルコース部分の近くに位置するリン酸と、切断される結合の近くに位置する４７２番目のアスパラギン酸が触媒に重要であることも明らかになりました。

CBAPは生物のエネルギー通貨であるアデノシン三リン酸（ATP）を消費することなく高エネルギーの産物（グルコース１−リン酸）を生成して下流の経路に送るため、微生物にとっては省エネルギー型の代謝経路であるといえます。従って、CBAPを持つ微生物は、酸化的セルロース分解の産物であるセロビオン酸から効率的に発酵を行い、エタノールなどの産物を作ることができます。微生物の酵素によるセルロース系バイオマスの利用法の開発は現在精力的に行われており、多糖の分解（糖化）プロセスと発酵プロセスを同時に行う一貫バイオプロセスの構築が重要視されています。本研究の成果は、バイオマスからバイオ燃料や様々な化学製品を作るバイオリファイナリー技術を開発する上で重要な基礎的情報となります。

なお、本研究は、農林水産省の農林水産業・食品産業科学技術研究推進事業「酵素工学を活用した糖質資源高度利用プラットフォーム構築」による支援を受けて行われました。