天然ペプチド骨格の合理的な設計手法の開発～天然物資源からの創薬研究がより簡便にスピーディーに～

ペプチド系天然物（注１）は、生理活性物質として重要なだけでなく抗体医薬をはじめ医薬品等の原料としても重要な物質です。特に内部アミノ酸が化学修飾を受けているペプチドは、薬効や物質安定性、体内動態に優れていることが知られており、そのようなペプチドをより簡便に多種類作り出すシステムの構築は創薬においても重要な技術の一つと言えます。
　本研究では、土壌中に棲む細菌の一種、放線菌（注２）の作り出すペプチド系天然物であるゴードスポリンの合成を、一日で簡便に達成する手法を確立しました。ゴードスポリンは化学修飾を受けているペプチド系天然物の一種です。この手法ではたった200塩基対からなる人工遺伝子をインプットするだけで、チューブを変えることなく丸一日でこのゴードスポリンを合成することができます（図1）。また、ゴードスポリンとは異なるアミノ酸配列を持つ多様なアナログ体も、投入する人工遺伝子の配列を取り替えるだけで簡便に創出することができる手法であるため、本研究グループではこの手法を用いて52種類のアナログ体の構築にも成功しました。さらにそのうちの一部については遺伝子組換え放線菌を用いた大量生産系へとつなげ、生理活性試験に必要な量を確保することも可能となっているため、本成果を足掛かりにペプチドを用いた創薬への有用な技術となることが期待されます。

放線菌は、結核の特効薬であるストレプトマイシンをはじめ、多様な抗生物質を作る土壌細菌です。このような性質から放線菌の探索を通して新規医薬品のシードとなる新たな天然物の発見が期待できます。また、現在では遺伝子組換え技術を組み合わせることで、天然物に人為的な修飾を加え、天然物を超える多様性を生み出すことも可能となりつつあります。今回、東京大学大学院農学生命科学研究科の尾仲宏康特任教授、東京大学大学院理学系研究科菅裕明教授および北里大学のグループは、放線菌が作るペプチド系天然物の一つであるゴードスポリンを試験管内で合成する手法の確立に成功しました。
　ゴードスポリンはペプチド系天然物のうちRiPPs（リボソーム合成と翻訳後修飾によって作られるペプチド）と呼ばれる大きな化合物群に属します。RiPPsはリボソームで翻訳されたペプチドが、翻訳後修飾酵素群によって修飾を受けて生合成される化合物の一群です。ゴードスポリンの生合成においては、構造遺伝子であるgodA遺伝子が転写・翻訳され49残基の前駆体ペプチドGodAが合成された後、C末端領域19残基がアゾール環化（注3）、デヒドロアラニン形成、N末端領域の消化、N-アセチル化の4段階、6個の酵素による翻訳後修飾反応を受けることでゴードスポリンが作られることが知られていました（図2）。
　本研究では、再構成無細胞翻訳系と翻訳後修飾酵素を組み合わせることで、人工的に合成したgodAの転写・翻訳からN-アセチル化反応までの全ての工程を、一つの試験管内で連続的に行い、ゴードスポリンを合成することに成功しました（図1）。このように遺伝子の転写翻訳から翻訳後修飾に至るまでの全ての工程を試験管内で再構成したRiPPs生合成系は世界初です。
　本手法では、人工合成が容易な長さの遺伝子さえ用意すれば、わずか200塩基対程度でもゴードスポリンやその類縁体RiPPsを簡便かつ迅速に合成することが可能です。この利点を活かして、全部で52種類のGodA変異体をデザインし、これらの前駆体ペプチド類縁体の翻訳後修飾反応を精査することで、翻訳後修飾酵素の基質特異性を明らかにしました。
　 研究グループの解析の結果、アゾール環形成酵素は、修飾を受けるセリン・システイン・スレオニン残基とその両隣の残基で構成される3残基の配列を認識して、アゾール環を導入することが分かりました。このアゾール環形成酵素の性質ゆえに、ゴードスポリンは2もしくは3残基の等間隔にアゾール環が配置された構造になっています。
この性質をもとに、新たに2残基をゴードスポリンの中央部位に挿入したGodA*-10SA11を設計したところ、予想通り新たに作られた3残基の認識配列に7つ目のアゾール環を導入することに成功しました。また、GodAのC末端領域19残基の配列を反復させ38残基にしたGodA*-tandemを用いることで、12か所のアゾール環形成にも成功しました。さらに、試験管内反応から得られた知見は、遺伝子組換え放線菌を宿主とした発酵生産にも応用可能であり、これら二つの特徴的なゴードスポリン類縁体を放線菌の代謝産物として生産することにも成功しました。
以上のように、本研究で多種類のRiPPsを簡便に迅速に合成できる手法を開発したことにより、ゴードスポリンにおける翻訳後修飾のルールの一端が明らかにされました。今後より詳細に解析を進めることで、ゴードスポリンの類縁体がより自在にデザインできるようになることが期待されます。また、本手法は他のRiPPs生合成系にも適用可能であることから、ゴードスポリンに限らず、今後さまざまなRiPPs生合成経路の解析が加速度的に進むことも期待されます。構造遺伝子への変異導入という遺伝子工学的な手法での類縁体創製が可能なことから、RiPPsは新たな生物活性物質創製のための魅力的なターゲットであり、本研究成果はRiPPs生合成経路のエンジニアリングにおける重要な指針を示したと言えます。

なお、本研究を行った東京大学大学院農学生命科学研究科微生物潜在機能探索寄付講座は、公益財団法人発酵研究所の寄付講座助成事業によって設立された寄付講座です。