「ニトレン転移反応を触媒する天然物生合成酵素の発見」

図１　放線菌の生産するベンザスタチン類（拡大画像↗）

放線菌 (注1) はさまざまな二次代謝産物 (注2) を生産しますが、それらの多くが有用な生理活性を持つため、医薬品資源として重要です。このため、二次代謝産物の生合成研究は有機化学・酵素学の発展に寄与するとともに、医薬品開発においても重要です。これまでに多くの研究者がさまざまな二次代謝産物の生合成機構の解明に取り組んできましたが、未だに生合成機構が明らかになっていない天然物も多く存在します。
　　東京大学大学院農学生命科学研究科、バイオ産業情報化コンソーシアム、沖縄科学技術大学院大学、産業技術総合研究所の共同研究グループはテトラヒドロキノリン骨格 (注3)、インドリン骨格 (注4) という二つの特徴的な多環骨格を有するベンザスタチン (BS) 類 (図1) に着目し、その生合成研究に取り組みました。その結果、ベンザスタチン類の多環骨格はBezEと名付けたシトクロムP450 (注5) が担うことを示しました。シトクロムP450は、通常は酸化反応を触媒する酵素ですが、BezEは酸化反応を触媒せず、代わりに酢酸の脱離によるニトレン (注6) の形成とニトレン転移反応を介して多環骨格形成を触媒することを明らかにしました。本酵素は自然界より発見された初めてのニトレン転移反応を触媒するシトクロムP450です。本研究により、天然物生合成における新たな多環構造形成戦略が明らかになりました。今後、本酵素の反応機構を詳細に解析し、その機能を改変することなどを通して、新規化合物の創出に応用することができると考えられます。

図２　BezJとBezGによるp-アミノ安息香酸の修飾経路とBezFによるp-アセトキシアミノ安息香酸のゲラニル化経路 （拡大画像↗）

図３　BezEによるニトレン転移反応によるテトラヒドロキノリン骨格とインドリン骨格の形成（拡大画像↗）

放線菌はストレプトマイシンやバンコマイシンといった二次代謝産物と呼ばれる有用天然物を生産することで知られています。これら放線菌由来の二次代謝産物はその有用性もさることながら、多種多様な化学構造をもち、その生合成にはさまざまな生体内の酵素反応が利用されています。これまで、さまざまな二次代謝産物の生合成経路が明らかにされてきていますが、未だに生合成経路が不明である化合物も多く存在します。東京大学大学院農学生命科学研究科、バイオ産業情報化コンソーシアム、沖縄科学技術大学院大学、産業技術総合研究所の共同研究グループはそれまで生合成経路が未解明であった、テトラヒドロキノリン骨格、インドリン骨格という二つの特徴的な多環骨格を有するベンザスタチン (BS) 類に着目し、その生合成研究に取り組んできました。^１）
　　BS類はゲラニル 2リン酸 (GPP) とp-アミノ安息香酸 (PABA) から生合成されることが予想されました。そこで、PABA合成酵素とGPPの転移を触媒する酵素の遺伝子を持つ生合成遺伝子クラスターを生産菌Streptomyces sp. RI18のゲノム情報を用いて探索しました。見つかった候補生合成遺伝子クラスターをStreptomyces lividansに導入した結果、ベンザスタチン類の異種生産に成功しました。^１）次に異種生産株にて生合成遺伝子クラスター中の生合成遺伝子の破壊を順次行い、生産される化合物（生合成中間体やそれが変換された化合物）を詳細に解析した結果、今回明らかにした生合成経路の全体像が浮かび上がってきました。特に重要な点として、シトクロムP450 (BezE)、アセチル基転移酵素 (BezG)、アミノ基酸化酵素 (BezJ) の3つの酵素が2つの多環骨格形成を担うことが強く示唆されました。
　　次にこれら3つの酵素の組換えタンパク質を利用した機能解析を試みました。しかし、BezJの組換えタンパク質を用いた解析は困難を極めました。そこで、BezJの反応産物であると予想したp-ヒドロキシアミノ安息香酸 (PHABA) を有機合成し、bezJ破壊株の培養液に添加したところ、テトラヒドロキノリン骨格、インドリン骨格を有するBS類の生産が回復しました。このことから、BezJがPABAのアミノ基の水酸化反応を触媒することが明らかになりました。次にアセチル基転移酵素であるBezGの組換えタンパク質を取得し、PHABAを基質に用いて試験管内で反応を行った結果、BezGがPHABAのO-アセチル化を触媒することでp-アセトキシアミノ安息香酸 (PAcABA) を合成することが明らかになりました (図2)。
次に、BezEの組換えタンパク質を利用した解析を行いました。BezEの基質は上述の結果から、ゲラニル化されたPAcABAであると予想されました (図2)。そこで、ゲラニル化PAcABAをPHABAからBezGとBezF (PAcABAなどのゲラニル化を触媒する酵素) を用いて調製し、BezEと反応させました。その結果、BezEがこの化合物を基質として、インドリン骨格を持つBSを合成する反応を触媒することが明らかになりました。さらに、クラスター中のその他の生合成酵素の組換えタンパク質と組み合わせて解析を行うことで、BezEはゲラニル基に入る修飾に応じてインドリン骨格とテトラヒドロキノリン骨格を有するBS類を作り分けていることが示されました (図3)。また、この試験管内反応の結果から、この環化反応の過程で、BezEが酢酸の脱離によるニトレンの形成と転移による環化反応を触媒することが強く示唆されました。
　　以上の実験結果から、多環構造を持つBS類の生合成は以下のように起こることがわかりました。まず、BezJとBezGによりp-アミノ安息香酸からPAcABAが形成されます。それと並行して、GPPがメチル化や水酸化を受けることで、メチルゲラニル 2リン酸 (MGPP) やヒドロキシメチルゲラニル 2リン酸 (HMGPP) が合成されます。BezFによりGPP、MGPPもしくはHMGPPのGPP類とPAcABAから3種類のゲラニル化PAcABAが合成されます (図2)。これらのゲラニル化PAcABAはBezEの触媒するニトレン転移を介した環化反応によりインドリン骨格 (GPP、MGPP由来の場合) またはテトラヒドロキノリン骨格 (HMGPP由来の場合) を有するBS類へと変換されます (図3)。これまでに、進化工学を利用して酵素改変されたシトクロムP450がニトレン転移反応を触媒することができたという報告はありましたが、この反応を行う天然の酵素は見つかっておらず、今回の発見は、天然物の生合成にニトレン転移反応が用いられていることを示した最初の例になりました。
　　以上のように本研究では、BS類の生合成経路の解明により、ニトレン転移反応を触媒する新規なシトクロムP450を見出すことに成功しました。シトクロムP450は産業上極めて有用な酵素ファミリーであるため、この発見は世界中に大きなインパクトを与えたと言えます。今後BezEの構造解析を通じてニトレン転移反応の触媒機構が明らかになることが期待できます。

１）林貴之　東京大学博士論文（2013）