細菌が澱粉を独り占めするために使われている酵素の構造を解明

　環状オリゴ糖はいくつかの糖が環状に連なったオリゴ糖であり、安定性に優れ、還元性をもたないことからメイラード反応（注１）も起こしません。そのため、現在食品のみならず多くの分野で利用されています。環状α-1,6-マルトシルマルトース（CMM）は、株式会社 林原の研究部門が発見した四つのグルコースから構成される環状オリゴ糖の一種です。このCMMは一般的なアミラーゼ（α-アミラーゼ；注２）では分解されませんが、CMMヒドロラーゼ（CMMase）という特殊な酵素によって効率的に分解されることが明らかとなっていました。今回、東京大学大学院農学生命科学研究科の河野正樹 社会人博士課程（当時）、伏信進矢教授らのグループは、このCMMaseの立体構造を明らかにしました。その結果、CMMaseはCMMがぴったりとはまるようなポケットを持っており、その形は三つの特徴的な箇所によって支えられていることが明らかとなりました。さらに、このようにCMMに対応した特徴的なポケットを持つ類似の酵素遺伝子は、その他の多くの細菌にも存在していることがわかりました。本研究は、細菌が炭素源獲得競争を有利にするためのユニークな代謝経路に関する新たな知見を与えただけでなく、今後のオリゴ糖開発や製法改善にも役立つことが期待されます。

　酵素技術の発展や健康志向の高まりから、各種オリゴ糖などの機能性糖質が注目されています。それら機能性糖質のうち、トレハロースやサイクロデキストリン（注３）はアミノ酸やタンパク質などが一緒に存在しても着色性を示さない非還元性のオリゴ糖として知られています。そして、これらのオリゴ糖は様々な機能性を示すことから、食品・化粧品・医療品など多くの分野で使用されています。特に環状オリゴ糖は、近年においても様々な種類が発見され、それぞれの特性による多分野への応用が期待されています。
　株式会社 林原の研究部門は、2005年に土壌中の微生物であるArthrobacter globiformis M6株が四つのグルコースから構成される新規の環状オリゴ糖（環状四糖）を作り出していることを発見しました。それまでに、環状四糖としてはα-1,3、1,6グリコシド結合（注４）が交互に存在する一種類（環状α-1,6-ニゲロシルニゲロース；CNN）しか知られておらず、ここで新たに見つかったものはα-1,4、1,6結合が交互に存在する環状α-1,6-マルトシルマルトース（CMM）でした。そして、このCMMは、α-1,4結合を加水分解する一般的なα-アミラーゼやその他の分解酵素でも分解されませんでした。さらに、このCMMを作り出す酵素（6-α-マルトシルトランスフェラーゼ；6MT）とCMMを分解する酵素（CMMヒドロラーゼ；CMMase）を発見して、これら酵素の遺伝子の隣には、菌体内へCMMを取り込む輸送体の遺伝子が存在していたことから、本菌が新たな環状糖であるCMMを経由して澱粉をエネルギー源として利用する代謝経路を持つことが見出されました（図１）。
　株式会社 林原 研究部門 新素材開発部 河野正樹 研究員は同社に入社後、社会人博士課程の学生として東京大学大学院農学生命科学研究科の伏信進矢教授、荒川孝俊助教らのグループに加わり本研究を行いました。研究グループはCMMの酵素の立体構造と分子機構を明らかにしました。
　CMMaseは糖質加水分解酵素（注５）ファミリー13のサブファミリー20（GH13_20）に属しており、同じファミリーには基質特異性が幅広いものや糖転移活性を示すような酵素が多く存在しています。しかし、CMMaseはCMMに非常に特異的であり、加水分解しか行わないことから、この酵素がどのようにCMMを認識し、加水分解を行っているのかに興味が持たれました。そこで、この酵素の立体構造をX線結晶構造解析（注６）により調べ、同じGH13_20に属しているネオプルラナーゼと比較を行いました。ネオプルラナーゼは基質特異性が幅広く、加水分解のみならず、糖転移活性も示すユニークな酵素として知られていますが、CMMを分解することができません。CMMaseの主鎖構造（単量体の構造）はネオプルラナーゼとよく似ていましたが、四次構造（二量体の構造）が大きく異なっており、ユニークな羽根状の四次構造を形成していました（図２A）。また、基質が結合するポケットはCMMがぴったりと当てはまるような形になっていることがわかりました。このポケットはPYF（プロリン、チロシン、フェニルアラニン）、CS（システイン、セリン）およびY（チロシン）からなり（図２B）、ネオプルラナーゼなど他のGH13_20に属する酵素とは全く異なっていました。そこで、CMMaseのこの三箇所のアミノ酸をネオプルラナーゼと同じものに変えたところ、CMMを分解する効率が著しく低下することを確認しました。したがって、CMMaseのCMMに対する特異性はこの三箇所のアミノ酸によってつくられた触媒ポケットの全体的な形状によって支えられていることがわかりました。また、岡山大学自然生命科学研究支援センターの太田弘道助教によってCMMの単結晶構造解析が行われ、CMMaseに結合したCMM分子と比較したところ、酵素に結合したCMMは最小エネルギー構造の一つをとっていることが明らかとなりました。さらに、本研究から得られた知見を元に類似酵素を探したところ、Arthrobacter globiformis以外にも多くの菌種においてCMMaseと同様の活性を持つと考えられる酵素が存在していることが明らかとなりました。そのため、これらの菌種においても、A. globiformis M6株と同様のCMM代謝経路を持っていることが考えられます。
　今回、CMMaseの立体構造を解明することにより、特殊な環状オリゴ糖であるCMMをA. globiformis M6株が菌体内で分解して利用する分子機構の一端が明らかとなりました。今後はCMMの生成および取り込みに関わる酵素・タンパク質についてのさらなる研究が必要ですが、このような特殊な代謝経路を持つ生物学的意義としては澱粉を一度環状オリゴ糖に変換することによって他の細菌が食べることのできないようにし、独占してしまうことであると考えられます。そして、本研究は環状オリゴ糖代謝経路の研究において重要な知見を提供しただけではなく、今後の新規オリゴ糖の創出や既存オリゴ糖製法の改善にも役立つことが期待されます。