発表者
上間(竹中)　亜希子 (東京大学大学院農学生命科学研究科　獣医微生物学　特任助教)
村上　晋 (東京大学大学院農学生命科学研究科　獣医微生物学　准教授)
潮　奈々子 (東京大学大学院農学生命科学研究科　獣医病理学　博士課程大学院生)
北村(小林)　知也 (東京大学大学院農学生命科学研究科　獣医微生物学　博士課程大学院生)
上間　匡 (国立医薬品食品衛生研究所　食品衛生管理部　室長)
内田　和幸 (東京大学大学院農学生命科学研究科　獣医病理学　准教授)
堀本　泰介 (東京大学大学院農学生命科学研究科　獣医微生物学　教授)

発表のポイント

  • 反芻家畜に異常産を引き起こすアカバネウイルスのゲノムを操作しました。
  • 感染細胞において緑色蛍光を高度に発現する組換えアカバネウイルスの作出に成功しました。
  • 組換えアカバネウイルスは、マウスモデルにおいて野生型ウイルスと同等の病原性を示すとともに、脳組織における感染動態を蛍光によりトレースしました。

発表概要

　アカバネウイルスは、ヌカカ(注1)の媒介によりウシなどの反芻動物に感染すると神経症状、もしくは胎児に関節湾曲症や水無脳症などを伴う異常産を主徴とするアカバネ病を引き起こします。アカバネ病が発生すると家畜に多大な被害が出るため、わが国ではワクチンが広く使われていますが、その効果は万全ではありません。感染した動物の体内におけるウイルス動態を明らかにすることがその病原性発現機構の解明、そして今後の感染対策を講じるために重要です。今回私たちは、リバースジェネティクス法(注2)により、人工的に構築したアンビセンス鎖ゲノム分節の非翻訳領域に欠損変異を導入することで、蛍光を高度に発現する組換えアカバネウイルスの作出に成功しました。この組換えウイルスのマウスにおける病原性は野生型ウイルスと同等であること、さらに、マウスモデルにおいて蛍光発現を指標に脳内でのウイルス動態をトレースできるレポーターウイルスになることがわかりました。本研究で得られた蛍光高度発現組換えアカバネウイルスは、ウシなどの家畜体内でのウイルス動態を生理的状態下で解析できること、さらに神経症状や異常産を引き起こすメカニズムを解明するための有用なツールになることが期待されます。

発表内容


図.　緑色蛍光高度発現組換えアカバネウイルス　(A)  5’非翻訳領域の部分欠損アンビセンス鎖S分節(S-eGFP/38)の構築、(B) 組換え欠損ウイルスeGFP/38-AKAVの培養細胞における蛍光発現の増強、(C) eGFP/38-AKAVを接種したマウスの脳組織に見られる蛍光(中央写真は左白枠内の拡大)。C:大脳、Cb:小脳、SC:脊髄、P:橋、M:延髄

　畜産業に莫大な被害を及ぼすアカバネ病の効果的な制御法の開発が期待されています。しかし、その開発に必要なアカバネウイルスの病原性発現機構はわかっていません。アカバネウイルスは、ブニヤウイルス目(注3)ペリブニヤウイルス科に属する三分節(L, M, S)のマイナス鎖RNAをゲノムとします。私たちは過去に、そのうちのS分節に緑色蛍光蛋白質eGFP遺伝子をプラス鎖に搭載した人工アンビセンス鎖をもつ組換えウイルスをリバースジェネティクス法により作出したところ、感染細胞内で蛍光発現を認めました(参考論文:Takenaka-Uema et al. J. Virol. 89, 9477-84, 2015)。しかし、その蛍光はウイルスの感染にやや遅れて発現するため、動物での生体内イメージング(in vivo imaging)解析には適しませんでした。今回私たちは、この蛍光発現のタイムラグを改善するため、プラス鎖に搭載したeGFP遺伝子の転写プロモーターを含むゲノムS分節の5’側非翻訳領域に欠損変異(図A)をもつ組換えウイルスを作出、解析したところ、83塩基の欠損変異をもつ変異体(eGFP/38-AKAV)において、培養細胞上の蛍光発現がタイムラグなしに高度に増強することを見つけました(図B)。さらに、ウイルスを継代しても蛍光発現は安定に維持されることがわかりました。

　次に、組換えウイルスeGFP/38-AKAVの病原性をマウスモデルで調べたこところ、野生型ウイルスと同等以上の致死性が見られました。感染マウスの中枢神経組織(大脳、小脳、延髄など)でも、野生型ウイルスと同等量のウイルス抗原が認められました。一方、実体蛍光顕微鏡で観察することで、蛍光で示される各脳組織におけるウイルス感染部位の局在と分布が明らかになりました(図C)。

　本研究により、蛍光を高度に発現する組換えウイルスeGFP/38-AKAVが、ウシなどの動物におけるウイルス動態の生体内イメージング解析に応用できることが示されました。したがって、この組換えウイルスは、アカバネウイルスの病原性解析や新規ワクチン開発などアカバネ病制御のための研究に貢献しうる有用なツールとなります。さらに、この組換えウイルスの構築技術は、他の病原性ブニヤウイルスの研究にも応用できると考えられます。

　本研究は、日本学術振興会科学研究費補助金の支援を受けて行われました。

発表雑誌

雑誌名
「Viruses」
論文タイトル
Generation of a GFP reporter Akabane virus with enhanced fluorescence intensity by modification of artificial ambisense S genome
著者
Akiko Takenaka-Uema, Shin Murakami, Nanako Ushio, Tomoya Kobayashi-Kitamura, Masashi Uema, Kazuyuki Uchida, Taisuke Horimoto
DOI番号
10.3390/v11070634
論文URL
https://www.mdpi.com/1999-4915/11/7/634/htm

問い合わせ先

東京大学大学院農学生命科学研究科 獣医学専攻 獣医微生物学研究室
特任助教　上間(竹中)　亜希子(うえま(たけなか)　あきこ)
Tel:03-5841-5398
Fax:03-5841-8184
Email: atakiko<アット>mail.ecc.u-tokyo.ac.jp　<アット>を@に変えてください。

教授　堀本　泰介(ほりもと　たいすけ)
Tel: 03-5841-5396
Email: ahorimo<アット>mail.ecc.u-tokyo.ac.jp　<アット>を@に変えてください。

用語解説

  • 注1　ヌカカ
    ヌカカは、ハエ目ヌカカ科に属する昆虫。体長が1から数mmほどの小型昆虫で、メスは蚊と同様に吸血する。アカバネウイルスは主にCulicoides属のヌカカによって媒介される。
  • 注2　リバースジェネティクス法
    アカバネウイルスの3種類のRNAゲノム分節を発現するプラスミドDNAを培養細胞に導入することで組換えアカバネウイルスを合成する方法。変異を導入したプラスミドDNAを用いることで、変異アカバネウイルスを作出することができる。
  • 注3　ブニヤウイルス目
    ラッサ熱ウイルス等が属するアレナウイルス科、ハンターンウイルス等が属するハンタウイルス科、クリミア・コンゴ出血熱ウイルスが属するナイロウイルス科、SFTSウイルスやリフトバレー熱ウイルス等が属するフェヌイウイルス科、そしてアカバネウイルス、アイノウイルス等が属するペリブニヤウイルス科で構成される。吸血性の節足動物が媒介するウイルスが多い。