発表者

榊　　渓(東京大学生物生産工学研究センター/東京大学大学院農学生命科学研究科　応用生命工学専攻　修士課程2年)
大石恵太(東京大学生物生産工学研究センター/東京大学大学院農学生命科学研究科　応用生命工学専攻　修士課程:当時)
清水　哲(東京大学生物生産工学研究センター　博士研究員:当時)
小林一幾(東京工業大学科学技術創成研究院化学生命科学研究所　博士課程大学院生:当時)
森　直紀(東京大学大学院農学生命科学研究科　応用生命化学専攻　助教:当時)
松田研一(東京大学生物生産工学研究センター/東京大学大学院農学生命科学研究科　応用生命工学専攻　博士課程大学院生:当時)
富田武郎(東京大学生物生産工学研究センター　助教)
渡邉秀典(東京大学大学院農学生命科学研究科　応用生命化学専攻　教授:当時)
田中　寛(東京工業大学科学技術創成研究院化学生命科学研究所　教授)
葛山智久(東京大学生物生産工学研究センター　准教授:当時/東京大学大学院農学生命科学研究科　応用生命工学専攻　教授:現在)
西山　真(東京大学生物生産工学研究センター　教授)

発表のポイント

  • シアノバクテリアのビオチン生合成に関わる新規生合成酵素BioUを発見しました。
  • BioUは自身のリジン残基を介して基質と共有結合した中間体を経て、1つの活性中心で3段階の反応を触媒することを明らかにしました。
  • BioUは一回反応を触媒すると酵素活性を失ってしまう「自殺酵素」と呼ばれる非常に珍しい酵素であることを明らかにしました。

発表概要

　東京大学生物生産工学研究センター 西山真教授らの共同研究グループは、シアノバクテリア(注1)のビオチン(注2)生合成に関わる新たな生合成酵素BioUを発見し、その反応機構を解明しました。これまで、8-アミノ-7-オキソノナノエート(8-amino-7-oxononanoate, AON)から7,8-ジアミノノナノエート(7,8-diaminononanoate, DAN)への変換を担うアミノ基転移酵素BioAが関わるビオチン生合成経路のみが知られていましたが、シアノバクテリアSynechocystis sp. PCC 6803ではBioAをコードする遺伝子がゲノム上に保存されておらず、その代わりにBioUが機能していることが明らかになりました。同共同研究グループは、X線結晶構造解析(注3)により計5種のBioUの立体構造を決定することに成功し、BioUは自身のリジン残基を介してAONと共有結合した後、溶存のCO2を付加し、DANカルバミン酸を生成するという3つの反応(還元反応、CO2付加反応、酸化反応)を1つの酵素で行う酵素であることを明らかにしました(図1)。また、BioUはこの一連の反応過程で自身のリジン残基のアミノ基をDANカルバミン酸へ供与してしまうため、一回の反応しか触媒できない「自殺酵素」と呼ばれる非常に珍しい酵素であることが明らかになりました。近年、ビオチンと同じビタミンB群補酵素の1つであるチアミンの生合成にも自殺酵素が関与していることが報告されました。これら自殺酵素が一回の反応を終えた後、活性型へと再生されるのか、再生されないとすると、それらが生体で一体どのような機能を持つのかに関しては未解明です。今後、補酵素生合成経路に共通して存在する自殺酵素の生体での意味の解明が待たれます。

発表内容


図1　本研究で明らかになったBioUが関わる新たなビオチン生合成経路


図2　既知のビオチン生合成経路


図3　 BioUの結晶構造
左:BioUの全体構造、中央:BioU-DAN共有結合体の活性中心の様子、右:BioUの活性中心におけるDANカルバミン酸アナログ分子の結合の様子。

　補酵素生合成経路は一次代謝の中でも多様な経路をもつことが知られ、それらを担う生合成酵素もユニークな反応機構を有するものが多く存在しています。東京大学生物生産工学研究センター 西山真教授、東京大学大学院農学生命科学研究科 渡邉秀典教授(当時)、東京工業大学科学技術創成研究院化学生命科学研究所 田中寛教授らの共同研究グループは、新たな補酵素生合成経路の解明を目指し、既知の生合成経路を有さない生物種の探索に着手しました。同共同研究グループは、バイオインフォマティクス解析によりシアノバクテリアSynechocystis sp. PCC 6803のビオチン生合成経路において既知の生合成酵素が保存されていない「ミッシングリンク」が存在することを見出しました。ビオチンの生合成経路は生物によって異なる経路を辿りますが、生合成後半部では全生物で共通の酵素群であるBioF、BioA、BioD、BioBが順に機能することでビオチンが生合成されることが知られています(図2)。しかしながら、シアノバクテリアにおいて、ビオチン生合成遺伝子のうちbioAのみがゲノム上に存在していませんでした。同共同研究グループは、遺伝学的解析によりシアノバクテリアでbioAの代わりにビオチン生合成に関与する機能未知遺伝子を見出し、この遺伝子をbioUと命名しました。

当初BioUはBioAが触媒するAONからDANへの変換反応を行うものと予想しました。しかしながら、生化学的な機能解析を行うとBioUはBioAのようにAONからDANを生成するのではなく、BioU自身を構成するアミノ酸残基を介して基質AONと結合し、BioU-DAN共有結合体を形成することが明らかになりました。基質AONとの結合の様子を明らかにするためBioU-DAN共有結合体のX線結晶構造解析を行い、BioUは自身のリジン残基(Lys124)を介して共有結合体を形成することを明らかにしました(図3左、中央)。次に、BioU-DAN共有結合体から生成する生合成中間体を明らかにするため、BioUの次の反応を担う酵素であるBioDを用いた反応解析を行いました。BioDは2段階の反応によってDANからデチオビオチンを生成する酵素であり、第1段階目の反応ではDANの7位の窒素原子に溶存のCO2が結合したDANカルバミン酸を反応中間体として生成します。BioU-DAN共有結合体とBioDを反応させるとデチオビオチンの生成は検出されましたが、BioDの1段階目の反応の基質となるDANは検出されませんでした。そこで、BioUは生合成中間体としてBioDの2段階目の反応の基質となるDANカルバミン酸を生成すると予想しました。このように仮定すると、DAN が検出されないにも関わらずデチオビオチンが生成した先ほどの実験結果をうまく説明することができます。DANカルバミン酸の生成機構を明らかにするためX線結晶構造解析を行い、BioUとDANカルバミン酸の7位の窒素原子を炭素原子に置換したアナログ分子の複合体結晶構造を決定しました。BioUの活性中心には、ヒスチジン残基とアスパラギン残基からなる触媒2残基によって、DANカルバミン酸のCO2付加部位に相当するカルボキシ基が認識されたアナログ分子が結合していました(図3右)。これら2残基を改変したBioUをBioDとともに反応させると、デチオビオチンの生成が消失しました。したがって、BioUはこれら触媒2残基によってBioU-DAN共有結合体に対し溶存のCO2を付加して、BioU-DANカルバミン酸を生成し、その後NAD+依存的にDANカルバミン酸を生成することが明らかになりました。

　また、一連の過程ではアミノ基供与体を加えることなくデチオビオチンが生成したことから、BioUのリジン残基自身がアミノ基供与体として機能しDANカルバミン酸へ供与されることが考えられました。この場合、リジン残基のアミノ基は反応後にセミアルデヒド基へと変換されることが考えられます。同共同研究グループは高分解能質量分析を行い、リジン残基のセミアルデヒド基への変換に伴う1.03 Daの質量変化を検出することに成功し、BioUのリジン残基自身がアミノ基供与体として機能することを示しました。反応後に生じるセミアルデヒド体は、AONは結合してBioU-DAN共有結合体を形成する活性を失っていることも確かめられ、BioUは一回の反応触媒で不活化してしまう自殺酵素と呼ばれる非常に珍しい酵素であることが証明されました。bioUは進化的に古い生物である好塩性古細菌にも保存されており、BioUが関わる経路は原始的なビオチン生合成経路である可能性があります。自殺酵素が関わるビオチン生合成経路の解明は、自殺酵素と補酵素生合成系の進化的関係性の解明にもつながる重要な研究成果です。

本研究は、日本学術振興会科学研究費補助金、ビタミンB研究委員会の助成を受けて行われました。

発表雑誌

雑誌名
「Nature Chemical Biology」
論文タイトル
A suicide enzyme catalyzes multiple reactions for biotin biosynthesis in cyanobacteria
著者
Kei Sakaki*, Keita Ohishi*, Tetsu Shimizu, Ikki Kobayashi, Naoki Mori, Kenichi Matsuda, Takeo Tomita, Hidenori Watanabe, Kan Tanaka, Tomohisa Kuzuyama, and Makoto Nishiyama
DOI番号
10.1038/s41589-019-0461-9
論文URL
https://www.nature.com/articles/s41589-019-0461-9

問い合わせ先

東京大学生物生産工学研究センター　細胞機能工学部門
教授　西山　真　(にしやま　まこと)
Tel:03-5841-3074
Fax:03-5841-8030
E-mail:umanis <アット>mail.ecc.u-tokyo.ac.jp　<アット>を@に変えてください。

用語解説

  • 注1　シアノバクテリア
    地球上で初めて酸素発生型光合成を行った原核生物として知られる。植物の葉緑体の祖先と考えられている。
  • 注2　ビオチン
    カルボキシラーゼの補酵素として機能するビタミンの1種。糖やアミノ酸、脂肪酸代謝など生体内の重要な代謝に関与しており、全ての生物に必須な栄養素。
  • 注3　分子疫学解析(molecular epidemiology)
    タンパク質の結晶にX線を照射し得られた回折データを解析することで、その立体構造を原子レベルで明らかにする手法。