In-frame変異により短縮型ジストロフィンタンパク質を作るラットを作製〜世界初となるヒトベッカー型筋ジストロフィー(BMD)モデル動物〜

発表者: 寺本奈保美 (東京大学大学院農学生命科学研究科　獣医学専攻　博士課程)
杉原　英俊 (東京大学大学院農学生命科学研究科　獣医学専攻　博士課程)
山内啓太郎 (東京大学大学院農学生命科学研究科　獣医学専攻　准教授)
中村　克行 (帝人株式会社)
木村　公一 (東京大学医科学研究所附属病院　特任助教)
岡野　智子 (東京大学医学部附属病院　検査部　主任臨床検査技師)
志賀　崇徳 (東京大学大学院農学生命科学研究科　獣医学専攻　博士課程)
白川　卓 (神戸学院大学　総合リハビリテーション学部　研究員)
松尾　雅文 (神戸学院大学　総合リハビリテーション学部　特命教授)
永田　哲也 (東京医科歯科大学　脳神経病態学分野　プロジェクト准教授)
大門　雅夫 (東京大学医学部附属病院　検査部　講師)
松脇　貴志 (東京大学大学院農学生命科学研究科　獣医学専攻　准教授)
西原　眞杉 (東京大学大学院農学生命科学研究科　獣医学専攻　名誉教授)

発表のポイント

ジストロフィン遺伝子にin-frame変異をもち、短縮型ジストロフィンタンパク質を作るラットの作製に成功した。
このラットの筋肉では、ヒトベッカー型筋ジストロフィーに特徴的な短縮型ジストロフィンタンパク質の分布や量の減少がみられ、持続的な損傷が観察された。
このラットは、ベッカー型筋ジストロフィーの病態進行機序解明や治療法開発のうえで優れた新規モデル動物となることが期待される。

発表概要

　東京大学大学院農学生命科学研究科の寺本奈保美大学院生、杉原英俊大学院生、山内啓太郎准教授らの研究グループは、ジストロフィン遺伝子にin-frame変異(注1)をもち、短縮型のジストロフィンタンパク質を作るラット(BMDラット)の作製と系統化に世界で初めて成功しました。
　X染色体型筋ジストロフィーはX染色体上に存在するジストロフィン遺伝子の変異により引き起こされる遺伝性のヒト筋原生疾患で、筋肉の持続的な損傷を特徴とします。X染色体型筋ジストロフィーには、ジストロフィンタンパク質が全く作られないデュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)と短縮型のジストロフィンタンパク質が作られるベッカー型筋ジストロフィー(BMD)があり、BMDでは不完全ながらもジストロフィンタンパク質が存在するためDMDに比べて一般的に病態は軽度とされています。しかし、作られる短縮型ジストロフィンタンパク質の構造や量によってDMDとほぼ同等の重篤な症状を示す場合もあります。BMDの筋肉に存在する短縮型ジストロフィンタンパク質を観察すると“patchy and faint(まだらで弱い)”とよばれる特徴的な分布を示すことが知られています。このような短縮型ジストロフィンタンパク質の分布の変化や量の減少がBMDの病態に関わると考えられてきましたが、その検証に利用できるようなモデル動物はこれまでに存在しませんでした。
　BMDラットでは、研究グループが過去に報告したDMDラット(注2)に比べ病態の進行が軽度であるとともに、筋肉で作られている短縮型ジストロフィンタンパク質の分布はまだら(patchy)で、その量も正常ラットの約10%程度にまで減少(faint)していました。このことから、BMDの病態進行機序解明や治療法開発のうえで非常に優れたモデル動物となることが期待されます。

発表内容

　X染色体型筋ジストロフィーはX染色体上に存在するジストロフィン遺伝子の変異により引き起こされる遺伝性の筋原生疾患です。ジストロフィン遺伝子から作られるジストロフィンタンパク質は筋線維細胞膜の安定性を担う重要な因子で、X染色体型筋ジストロフィーにはout-of-frame変異(注3)によりジストロフィンタンパク質が全く作られないデュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)と、in-frame変異により短縮型のジストロフィンタンパク質が作られるベッカー型筋ジストロフィー(BMD)があります。DMDとBMDはともに筋肉の持続的な損傷を特徴としますが、BMDでは不完全ながらもジストロフィンタンパク質が存在するためDMDに比べて一般的に病態は軽度とされています。しかし、BMDの中には作られる短縮型ジストロフィンタンパク質の構造や量によってDMDとほぼ同等の重篤な症状を示す場合もあります。BMDの筋肉に存在する短縮型ジストロフィンタンパク質を観察すると“patchy and faint(まだらで弱い)”とよばれる特徴的な分布を示すことが知られています。このような短縮型ジストロフィンタンパク質の分布の変化や量の減少がBMDの病態に関わると考えられてきましたが、その検証に利用できるようなモデル動物はこれまでに存在しませんでした。
　研究グループは2014年にCRISPR/Cas法(注4)を用いて、ジストロフィン遺伝子に変異をもつラットを複数作製することに成功しました。それらを系統化したところ、1つの系統では、ジストロフィン遺伝子のエクソン領域に1,902塩基のin-frame欠損が生じており(図1)、その結果、筋肉では、正常なジストロフィンタンパク質(分子量427 kDa)よりも小さな短縮型ジストロフィンタンパク質(約350 kDa)が作られていました。筋肉における短縮型ジストロフィンタンパク質の分布や量を調べたところ、筋線維細胞膜直下にまだら(patchy)に存在しており、さらに、その量は正常ラットの約10%程度にまで減少(faint)していました(図2)。骨格筋や心筋ではX染色体型筋ジストロフィーに特徴的な損傷やそれに伴う炎症、線維化などが観察されましたが(図3)、いずれも研究グループが過去に作製したDMDラットに比べて軽度でした。以上のことから、今回系統化されたラットをヒトBMDの特徴を良く反映したモデルであるBMDラットと位置づけることにしました。
　ジストロフィンタンパク質には様々な分子量を持つアイソフォーム(Dp260、Dp140、Dp116、Dp71など)が存在することが知られています。興味深いことにBMDラットの筋肉では、ジストロフィンタンパク質のカルボキシル末端と共通のアミノ酸配列をもち、これまでに報告のない分子量約75 kDaのタンパク質(Dpx)が作られていることを見出しました。Dpxのもつ生理的役割については不明ですが、ジストロフィンタンパク質と同様に筋線維細胞膜直下に分布し、筋線維の安定化を担う他のタンパク質と複合体を形成することや、短縮型ジストロフィンタンパク質の減少に伴いその量が増加することなどから、BMDの発症機序に深く関わっている可能性が考えられます。
　これまでジストロフィンタンパク質を欠損するDMDのモデル動物としては、DMDラットをはじめとして、mdxマウス、筋ジストロフィー犬などがあります。一方、BMDにみられるようなジストロフィン遺伝子にin-frame変異をもつモデル動物は存在しませんでした。現在、DMDの遺伝子治療の1つとして、ジストロフィン遺伝子のout-of-frame型の変異をin-frame型の変異へと置換するエクソン・スキップとよばれる方法の開発が進められています。この場合、新たに作られるジストロフィンタンパク質は依然として短縮型であることから、病態は軽減されるもののBMDのような症状が依然として残る可能性が考えられます。
　以上より、研究グループが作製したBMDラットは、ヒトBMDの発症機序解明や治療法開発に役立つだけでなく、エクソン・スキップによる遺伝子治療の有効性をより高めていく上でも有用なモデル動物となることが期待されます。
　なお、本研究は、日本学術振興会科学研究費補助金(基盤研究(B)16H05041、基盤研究(C)17K07092、挑戦的萌芽研究15K14883、特別研究員奨励費17J08505)の支援を受けて行われました。

発表雑誌

雑誌名: 「Disease Models & Mechanisms」8月28日
論文タイトル: Pathological evaluation of rats carrying in-frame mutations in the dystrophin gene: A new model of Becker muscular dystrophy
著者: Naomi Teramoto, Hidetoshi Sugihara, Keitaro Yamanouchi*, Katsuyuki Nakamura, Koichi Kimura, Tomoko Okano, Takanori Shiga, Taku Shirakawa, Masafumi Matsuo, Tetsuya Nagata, Masao Daimon, Takashi Matsuwaki, and Masugi Nishihara
DOI番号: 10.1242/dmm.044701
論文URL: https://dmm.biologists.org/content/early/2020/08/28/dmm.044701.long

問い合わせ先

東京大学大学院農学生命科学研究科　獣医学専攻　獣医生理学教室
准教授　山内啓太郎(やまのうち　けいたろう)
Tel:03-5841-5387
Faxl:03-5841-8017
E-mail:akeita<アット>g.ecc.u-tokyo.ac.jp 　<アット>を@に変えてください。

用語解説

注1　in-frame変異
欠失または挿入の起こる塩基数が3の倍数であるため、翻訳の際、アミノ酸をコードする3つ組みの読み枠がずれない遺伝子変異。
注2　DMDラット
研究グループが2014年に作製したジストロフィンタンパク質を完全に欠損したラット。ヒトDMDと同様の病態を示す。
(文献)Nakamura K, Fujii W, Tsuboi M, Tanihata J, Teramoto N, Takeuchi S, Naito K, Yamanouchi K, Nishihara M. Generation of muscular dystrophy model rats with a CRISPR/Cas system. Sci Rep 4: 5635 (2014)
注3　out-of-frame変異
塩基の欠失または挿入により、アミノ酸をコードする3つ組みの読み枠がずれる変異。多くの場合、遺伝暗号(コドン)にずれが生じることで、翻訳の際のアミノ酸が変わり、より手前で終止コドンが現れたりする。
注4　CRISPR/Cas法

DNAを切断する酵素と標的とする遺伝子の一部と相補的な配列をもつガイドRNAを用いることで、標的部位に変異を導入する遺伝子改変技術の一つ。