発表者
川合 誠司 (東京大学大学院農学生命科学研究科 応用生命工学専攻 修士課程1年、
                            プロアクティブ環境学国際卓越大学院プログラム第4期生)
菅谷 優子 (東京大学大学院農学生命科学研究科 応用生命工学専攻 修士課程2年:当時)
萩原 亮太 (東京大学大学院農学生命科学研究科 応用生命工学専攻 修士課程2年:当時)
冨田 宏矢 (東京大学大学院農学生命科学研究科 応用生命工学専攻 特任助教)
勝山 陽平 (東京大学大学院農学生命科学研究科 応用生命工学専攻 准教授)
大西 康夫 (東京大学大学院農学生命科学研究科 応用生命工学専攻 教授)

発表のポイント

  • ジアゾ基を有するアミノ酸として古くから知られており、抗ガン活性を持つ6-diazo-5-oxo-L-norleucine (DON) の生合成経路が解明されました。
  • 新規酵素ファミリーに属する膜タンパク質が亜硝酸を利用してDONのジアゾ基を合成することが示されました。
  • 放線菌Streptomyces albusを利用してDONのN-アセチル化体の異種生産に成功しました。

発表概要

 アラゾペプチンは2分子の6-diazo-5-oxo-L-norleucine (DON)と1分子のL-アラニンから構成されているトリペプチド (注1) です。DONは最も有名なジアゾ基 (注2) をもつアミノ酸の1つであり、抗ガン活性をもつことから基礎医学研究で頻繁に用いられています。東京大学大学院農学生命科学研究科・応用生命工学専攻のグループは2種の放線菌 (注3) のゲノム解析、遺伝子破壊株の解析と組換えタンパク質を用いた試験管内酵素反応実験から、アラゾペプチン生合成の全容を明らかにしました。新規ファミリーに属する膜タンパク質(AzpL)が亜硝酸を用いたジアゾ化反応を触媒することを見出した点は特に重要です。さらに、3つのDON生合成遺伝子とDONのアセチル化酵素遺伝子を導入した放線菌Streptomyces albusの培養液に亜硝酸ナトリウムを添加することで、DONのN-アセチル化体を異種生産することにも成功しました。この発見により、ジアゾ基をもつペプチド化合物の医薬品開発の促進が期待されます。

発表内容


図1 ANS経路がその生合成に関与すると報告されている、N-N結合を有する化合物



図2 本研究で明らかになったアラゾペプチンの生合成経路

 生物はその生育に必須な一次代謝の他に、生育に必ずしも必要のない二次代謝を行うことがあります。この二次代謝により生み出される二次代謝産物は医薬品や染料などに利用されています。特に放線菌が生産する二次代謝産物は抗生物質や抗ガン剤などの医薬品に幅広く活用されています。また、放線菌により生産される二次代謝産物は興味深い化学構造をもつものが多く、新たな有用化合物を創り出すという観点からも、複雑な化学構造を生み出す生合成酵素の解析に注目が集まっています。
 ジアゾ基をはじめとする窒素-窒素 (N-N) 結合を有する化合物は、天然から約200種類程度報告されていますが、その生合成は近年までほとんど明らかにされていませんでした。東京大学大学院農学生命科学研究科・応用生命工学専攻のグループは過去にジアゾ基を有する芳香族化合物であるクレメオマイシンの生合成研究を行い、さまざまな放線菌が利用している二次代謝用の亜硝酸生合成経路を見出していました。1 ANS経路と命名された本経路は、CreEとCreDという2つの酵素によってL-アスパラギン酸から亜硝酸を生成します。この経路により作られる亜硝酸はジアゾ基をはじめとするN-N結合を有する複数の天然物の生合成に利用されることが示唆されていますが (図1)、その詳細なメカニズムは解明されていませんでした。
 同グループはジアゾ基を有するアミノ酸である6-diazo-5-oxo-L-norleucine (DON) 2分子とL-アラニン1分子からなるトリペプチドであるアラゾペプチンに着目しました。DONは抗ガン活性をもつため、古くから基礎研究に用いられている化合物です。また、アラゾペプチンもいくつかの癌細胞に対する抗ガン活性が報告されています。アラゾペプチンは2種類の放線菌、Streptacidiphilus griseoplanusKitasatospora azaticaが生産することが報告されています。まず、この2種の放線菌のゲノムを比較することでアラゾペプチンの推定生合成遺伝子クラスター (azpクラスター) (注4) を見出しました。このazpクラスター内にはANS経路を構成する遺伝子 (azpEazpD) が存在しました。
 次に、S. griseoplanusにおけるazpクラスター内の遺伝子のうち10個の遺伝子破壊株を構築し、代謝解析を行いました。その結果、azpE破壊株でアラゾペプチンと、その生合成中間体と考えられる2分子のDONが縮合したジペプチド (DON-DON) およびDONのN-アセチル化体 (N-Ac-DON) の生産が消失しました。また、azpE破壊株に亜硝酸ナトリウムを添加して培養したところ、これらの化合物の生産が回復しました。このことからDONとアラゾペプチンのジアゾ基がANS経路により形成される亜硝酸に由来することがわかりました。さらに、他の遺伝子破壊実験からN-Ac-DONの生合成にはANS経路以外に少なくとも2つの遺伝子 (azpKazpL) が必須であることがわかりました。さらに、azpK破壊株は5-ヒドロキシリシンを、azpL破壊株はDONを培養液に添加することで、アラゾペプチンの生産が回復したことから、AzpKがL-リシンを水酸化すること、AzpLがDONのジアゾ基合成に関与することが示唆されました。
 続いて、azpクラスター内の9遺伝子 (azpAazpCazpDazpEazpFazpGazpIazpJazpM) を大腸菌に導入し、組換えタンパク質を生産・精製し、試験管内で解析しました。その結果、これらの酵素、タンパク質の機能の同定に成功し、遺伝子破壊実験と合わせてアラゾペプチン生合成経路の全体像が明らかになりました (図2)。まず、AzpE、AzpDによりL-アスパラギン酸から亜硝酸が作られます。それと並行しAzpKによりL-リシンが水酸化されます。これにより合成された5-ヒドロキシリシンはAzpJにより酸化され、5-オキソリシンへと変換されます。5-オキソリシンはAzpLによりジアゾ化されDONが合成されます。DONはさらにAzpIによりアセチル化され、N-Ac-DONとなります。N-Ac-DONはAzpCにより活性化され、キャリアータンパク質であるAzpFにチオエステルを介して結合します。N-Ac-DONはAzpFに結合した状態でAzpGにより脱アセチル化されたあと、AzpMによりDON-DONへと変換されます。最後にAzpAがDON-DONにL-アラニンを縮合することでアラゾペプチンが作られます。
 一方、N-Ac-DON生産に必要な4つの遺伝子 (azpI、azpJ、azpK、azpL) を導入した放線菌Streptomyces albusを亜硝酸ナトリウムを含む培地で培養することでN-Ac-DONの異種生産に成功しました。亜硝酸ナトリウムを添加しなかった時、N-Ac-DONの生産は見られませんでした。さらにこの異種発現系を用いて、AzpLの機能解析を行いました。AzpLとその相同酵素間で保存性の高い10個の極性アミノ酸残基に着目し、部位特異的変異導入によりこれらのアミノ酸残基の重要性を調べたところ、93残基目のチロシンの水酸基がAzpLの活性に重要であることがわかりました。
 本研究によりジアゾ基を含むアミノ酸の生合成機構が世界で初めて明らかになりました。特にジアゾ基の形成を触媒する膜タンパク質AzpLの発見は極めて重要な成果です。AzpLは既知の酵素と類似性がなく、新規ファミリーに属する酵素と予想されます。ゲノムデータベースを調べたところ、上記2株以外の微生物もN-Ac-DON生合成遺伝子クラスターを保持していることがわかり、ジアゾ基をもつペプチドを作る微生物が他にも存在することが示唆されました。これらの菌を調べることで、ジアゾ基をもつ新規ペプチドを見出すことができると思われます。今回の発見により、ジアゾ基をもつペプチド化合物の医薬品開発の促進が期待されます。

参考文献

  1. Sugai, Y., Katsuyama, Y., & Ohnishi, Y. (2016). A nitrous acid biosynthetic pathway for diazo group formation in bacteria. Nature chemical biology12(2), 73-75.

発表雑誌

雑誌名
Angewandte Chemie International Edition(2月23日:オンライン版)
論文タイトル
Complete biosynthetic pathway of alazopeptin, a tripeptide consisting of two molecules of 6-diazo-5-oxo-L-norleucine and one molecule of alanine
著者
Seiji Kawai, Yuko Sugaya, Ryota Hagihara, Hiroya Tomita, Yohei Katsuyama*, and Yasuo Ohnishi
DOI番号
10.1002/anie.202100462
論文URL
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202100462

問い合わせ先

東京大学大学院農学生命科学研究科 応用生命工学専攻 醗酵学研究室
准教授 勝山 陽平(かつやま ようへい)
Tel:03-5841-5124
Fax:03-5841-8021
研究室URL:http://park.itc.u-tokyo.ac.jp/hakko/
E-mail:aykatsuhko<アット>g.ecc.u-tokyo.ac.jp  <アット>を@に変えてください。

用語解説

  • 注1 ペプチド
     2つのアミノ酸分子の片方のアミノ酸のカルボキシ基(-COOH)ともう片方のアミノ酸のアミノ基(-NH2)が脱水縮合した構造(-CONH-)をペプチド結合という。このペプチド結合により複数のアミノ酸が縮合した化合物をペプチドという。
  • 注2 ジアゾ基
     窒素原子2つからなる官能基(=N+=N-)。反応性が高く、さまざまな反応の足場として有機化学合成に用いられる。また、ジアゾ基を有するジアゾ化合物は、染料の原料としても用いられていることでも知られる。
  • 注3 放線菌
     原核生物の一群で、その多くが放射状に菌糸を伸長して生育することから名付けられた。通常の細菌と比較してゲノムサイズが大きく、二次代謝に関与する遺伝子も多く有している。抗生物質をはじめ、さまざまな生理活性を有する二次代謝産物を生産することから、創薬にも重要な微生物として知られている。
  • 注4 生合成遺伝子クラスター
     微生物において、特定の二次代謝産物の生合成遺伝子はゲノム上の一箇所にまとまって存在することがほとんどである。このような特定の二次代謝産物の生合成遺伝子の集まりを生合成遺伝子クラスターと呼ぶ。