東京大学大学院農学生命科学研究科・農学部

発表者

山崎 清志(東京大学 大学院農学生命科学研究科 応用生命化学専攻: 特任講師)
反田 直之(東京大学 大学院農学生命科学研究科 応用生命化学専攻: 助教)
藤原 　徹(東京大学 大学院農学生命科学研究科 応用生命化学専攻: 教授)

発表のポイント

• 化学変異原処理したイネ種子を成長させて得られる分げつ(枝分かれ)は異なる変異を持っていることを明らかにしました。この発見はイネの分げつの形成過程の一端を明らかにすると共に、イネの変異系統の作出を効率化することに役立ちます。

発表概要

　応用生命化学専攻植物栄養・肥料学研究室の山崎清志、反田直之、藤原徹は、イネ変異系統を作成する過程で、EMS変異原処理した種子から成長させた個体に稔る種子を分げつ毎に分けて収穫すると、収穫した種子は異なる変異を受け継いでいることを発見しました。
　種子には個体の元になる胚が既に形成されており、胚は多細胞から成ります。種子をEMS処理すると胚を構成する細胞それぞれが変異原処理を受けるため、細胞毎に異なる変異を持つことになります。胚を構成する細胞の内の1細胞がすべての次世代種子の元になるのであるならば、変異原処理した種子から成長させた個体に稔る種子は同じ変異を持つことになりますし、胚の異なる細胞に由来する次世代種子があるのであれば、それらの種子は異なる変異を持つことになります。　
　本研究では、変異原処理した種子から成長させた個体から分げつ毎に分けて種子を収穫し、その種子を発芽させて得られた個体のゲノム配列を次世代シーケンシング解析したところ、解析した個体は由来する分げつ毎に全く異なる変異を持つことが明らかになりました。
　変異原処理は育種や遺伝解析に用いられてきました。従来はEMS処理した種子1粒から植物が成長して分げつが生じても、いずれか一つの分げつからのみ次世代種子が収穫・栽培され遺伝資源とされることがほとんどでした。これは、得られるそれぞれの個体(種子)が異なる変異を持つことを保証するために行われているのではないかと推定しています。今回の研究成果により、イネの場合には、5本の分げつがあればそれぞれの分げつから、独立した変異を持つ5つの遺伝資源を取得できることがわかりました。また、胚の細胞がどのように次世代に受けがれるかについての知見ともなりました。
　この研究は、日本学術振興会(JSPS) 科学研究費補助金の支援を受けて行われました。

発表内容

【研究背景と内容】
　EMSなどの化学物質による変異原処理を行うと、DNA塩基配列上のランダムな位置に塩基置換などの変異を生じさせることができます。これを利用して植物の種子に変異原処理を行い、これまでに多くの植物種で変異体集団が作成されてきました。多数の変異系統からなる変異体集団は、集団が持つ変異の多様性が大きいほど良い研究材料であるため、異なる変異系統が同じ変異をできるだけ持っていないことが重要です。そこでイネを含め多くの植物種で変異体集団を作成する過程で、単粒法(Single Seed Descent、SSD法)が採用されてきました。これは各世代の変異体から収穫できるたくさんの種子から系統毎に1粒のみを採って次世代を育てる方法です。毎世代でSSD法を行い、集団が持つ変異の多様性を最大化するのが従来の方法でした。
　種子に変異原処理を行えば、種子胚を構成する細胞毎に異なる変異が生じます。よって、この種子胚から生じた最初の植物体(いわゆるM₁)は、葉や茎が種子胚のどの細胞に由来するかに応じて独立した変異を持つキメラ変異体(注3)となっているはずであり、この個体からは複数の独立した変異をもつ次世代(M₂)が生じる可能性が期待できます。しかしながら、イネを含む多くの植物種で変異原処理により変異体集団を作成する場合、M₁に対してもSSD法が採用され、1個体のM₁から収穫した種子のうち1個体だけが次世代M₂として育てられてきました。我々は、M₁の分げつがそれぞれ別の種子胚細胞に由来するのではないかと予想し、分げつ毎に次世代M₂を採種・栽培することで、1つのM₁個体から複数の独立した変異を持つ変異系統が得られるのではないかと考えました。
　本研究では、EMS変異原処理を行ったM₁イネから次世代種子を収穫する際に、分げつ毎に区別して収穫し、同じM₁の各分げつに由来するM₂兄弟のゲノム配列情報を次世代シーケンサーにより取得しました。同時に、EMS変異原処理を行っていないイネのゲノム配列情報も取得し、まずは両ゲノム配列を比較することでEMS処理によって生じた変異を特定しました。次にこの特定したEMS変異を兄弟間で比較することで、兄弟で同じEMS変異を持っているかどうかを確認しました。その結果、ある分げつに由来するM₂個体で検出される変異の多くが、他の分げつ由来の兄弟M₂では検出されないことがわかりました(図1)。
　次に、より具体的にEMS変異が分げつ間で独立していることを示すために、兄弟間のEMS変異の類似性に基づくクラスタリング解析を行いました。ある2個体の兄弟の類似性が100%に近ければその2兄弟はほとんど同じ変異をもつことになり、同じ種子胚細胞由来であったことを意味します。M₁の5本の分げつそれぞれから由来する5個体のM₂兄弟をクラスタリング解析に供した結果、5個体ないし4個体が持つ変異の99%以上がほかの兄弟では見られず類似性が1%未満であることがわかりました(図2)。つまり、同じM₁親の異なる分げつから生まれたM₂兄弟を、独立した変異体として扱えることが遺伝学的に示されたわけです(図3)。この結果は、変異体集団を作成する際にはより合理的な手法として、M₁に対して分げつ毎に次世代種子を採ることが有効であることを示しています。

【成果の意義】
　本研究の成果であるM₂兄弟の変異の独立性には、2つの大きな意義があります。まず手法の効率化として意義があり、従来法ではM₁の生存数≧最終的な変異系統数となっていましたが、我々の成果は同じ数のM₁種子から少なくとも4-5倍の変異が独立した変異系統を取得できることを示しました。もう一つはイネの発生学における意義です。M₂植物の細胞起源を辿ればM₁種子の種子胚を構成する細胞のいずれかになるはずですが、これまでイネでは次世代種子の起源となる種子胚細胞がいくつあるのかさえ不明でした。M₂兄弟のEMS変異の独立性は、それぞれの兄弟の細胞起源がすべて異なることを意味することから、イネでは種子胚細胞中の少なくとも5細胞が次世代種子の起源になりうることを示しました。今回得られた知見は、解剖学的に似ている同じ単子葉植物に適用できる可能性があり、イネだけでなく様々な植物種の変異原処理による変異体作成を必要とする研究に大きく貢献すると期待されます。

発表雑誌

雑誌名

The Plant Journal

論文タイトル

M₂ plants derived from different tillers of a chemically mutagenized rice M₁ plant carry independent sets of mutations

著者

Kiyoshi Yamazaki*, Naoyuki Sotta, Toru Fujiwara*

DOI番号

10.1111/tpj.16390

論文URL

https://doi.org/10.1111/tpj.16390

問い合わせ先

東京大学大学院農学生命科学研究科　 応用生命化学専攻 植物栄養・肥料学研究室
教授　藤原　徹(ふじわら とおる)
Tel/Fax:03-5841-5104
E-mail:atorufu <アット>g.ecc.u-tokyo.ac.jp 　<アット>を@に変えてください。
東京大学大学院農学生命科学研究科　 応用生命化学専攻 植物栄養・肥料学研究室
特任講師　山崎　清志 (やまざき きよし)
Tel/Fax:03-5841-5104
E-mail:akiyo <アット>g.ecc.u-tokyo.ac.jp 　<アット>を@に変えてください。

用語解説

• 注1　EMS変異原処理
  　化学変異原処理のうちの一つです。EMS(エチルメタンスルホン酸)を細胞に処理すると、細胞に入り込んだEMS分子がDNAに直接作用し、主に塩基置換を誘発します。植物では変異体を作成するのに種子に対して非常によく用いられる手法です。
• 注2　分げつ (英語ではtiller)
  　イネ科植物では枝分かれのことを分げつと呼びます。イネの種子は穂から収穫されますが、穂は分げつごとに一つ形成されます。本研究ではM₁植物のそれぞれの分げつに形成される穂から収穫した種子を区別して解析し、その差を分げつ間の変異の違いとして評価しています。
• 注3　キメラ変異体
  　同一個体内に異なった遺伝的背景を持つ細胞が混じっている個体をキメラといいます。本研究では異なったEMS変異を持つ細胞が混じっている個体を指しています。

関連教員

藤原 　徹